王 玲，郭志廷*，龔振興，蔡建平，楊 峰

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730050;2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730046)

中藥常山為虎耳草科植物常山(DichroafebrifugaLour.，DFL)的干燥根，味苦辛，性寒，具有殺蟲(chóng)、截瘧、祛痰之功效[1]。常山作為具有抗球蟲(chóng)活性的中藥材，可單獨(dú)使用或作復(fù)方制劑的主藥使用，而有效活性單體常山堿(即常山堿乙或常山乙素，febrifugine，dichroine B，β-dichroine)和異常山堿(即常山堿甲，isofebrifugine，dichroine A，α-dichroine)即為常山提取物中的抗球蟲(chóng)有效組分[2-4]。雞球蟲(chóng)病是一種全球流行、發(fā)病率高和死亡率高的腸道寄生蟲(chóng)病，全球每年因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失約為50億美元，我國(guó)在30億元左右，其中抗球蟲(chóng)藥物費(fèi)用約為6億元。目前雞球蟲(chóng)病防治主要依靠化學(xué)藥物，包括地克珠利、妥曲珠利及常山堿衍生物(如常山酮)等[5-6]。鑒于抗球蟲(chóng)化學(xué)藥物存在嚴(yán)重的耐藥性和藥物殘留，且中藥復(fù)方中抗球蟲(chóng)有效活性成分常山堿的含量偏低，目前迫切需要研發(fā)新型安全高效的抗球蟲(chóng)藥物。應(yīng)用現(xiàn)代中藥分離技術(shù)，提取中藥常山的有效活性成分常山堿，通過(guò)優(yōu)化生產(chǎn)工藝制備常山口服液，并將其用于防控雞球蟲(chóng)病，具有抗球蟲(chóng)療效好、低毒低殘留和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)擬通過(guò)人工感染雞柔嫩艾美艾球蟲(chóng)(E.tenella)復(fù)制病理模型，探討常山口服液對(duì)雞球蟲(chóng)病的臨床療效，并確定最佳給藥劑量，以期為今后常山口服液作為抗球蟲(chóng)新獸藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡的嶺南黃雛雞120只，購(gòu)自甘肅省蘭州華隴家禽育種公司。雛雞飼料購(gòu)自蘭州市富昌飼料廠(chǎng)，未添加任何抗球蟲(chóng)藥物。飼養(yǎng)條件與管理：在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房(經(jīng)嚴(yán)格消毒，無(wú)雞球蟲(chóng)卵囊污染環(huán)境)，隔離籠養(yǎng)。按常規(guī)飼喂飼料，自由采食飲水，飼養(yǎng)至14日齡，按體重隨機(jī)分組，分籠飼養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)藥物 常山口服液，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，黃色液體，常山堿含量為2.2 mg/50 mL。主要制備過(guò)程：常山提取物，加入1.0%的無(wú)水酒精助溶劑和4.0%的雙乙酸鈉防腐劑，調(diào)節(jié)pH值至7.2，過(guò)濾、分裝、冷藏，備用。

對(duì)照藥物：百球清(妥曲珠利溶液，口服制劑，含量2.5%)，購(gòu)自拜耳(四川)動(dòng)物保健有限公司，按生產(chǎn)廠(chǎng)家推薦劑量1.0 mL/L水，飲水給藥。

1.3 試驗(yàn)蟲(chóng)株 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)廣東株(1996年分離自廣東花都，對(duì)尼卡巴嗪輕度抗藥，對(duì)常山酮和克球粉中度抗藥，對(duì)球痢靈、氯羥吡啶、馬杜拉霉素、拉沙洛菌素、鹽霉素、莫能霉素嚴(yán)重抗藥)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所蔡建平研究員提供。

1.4 抗球蟲(chóng)試驗(yàn)

1.4.1 分組與給藥 雛雞飼養(yǎng)至12日齡時(shí)，連續(xù)兩天對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行糞便檢查，確定無(wú)球蟲(chóng)感染后，于14日齡開(kāi)始試驗(yàn)。感染前選取90只健康無(wú)球蟲(chóng)雛雞，飼喂前2 h禁止攝入飼料和水，逐只稱(chēng)重。選取體重相近雛雞，隨機(jī)分為9個(gè)組，每組10只。常山口服液6個(gè)藥物劑量組(分別為2.5、5.0、15.0、25.0、35.0、50.0 mL/L水，飲水給藥)、妥曲珠利對(duì)照組(1.0 mL/L水，飲水給藥)、攻蟲(chóng)不給藥組(感染對(duì)照組)和不攻蟲(chóng)不給藥組(健康對(duì)照組)。除不攻蟲(chóng)不給藥組外，其余各感染組每只雞經(jīng)口接種完全孢子化卵囊7×104個(gè)(卵囊為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)廣東株球蟲(chóng)孢子化卵囊)，接種24 h后，開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥7 d。第8天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)每組存活雞進(jìn)行單只稱(chēng)重，統(tǒng)計(jì)存活率，計(jì)算各組相對(duì)增重率。

1.4.2 臨床及病理剖檢觀(guān)察 接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后，觀(guān)察和記錄各組試驗(yàn)雞的發(fā)病情況及臨床表現(xiàn)。感染后第3天，每天檢查糞便，記錄血便情況，直至試驗(yàn)結(jié)束。感染后第5～8天，每天收集糞便稱(chēng)重，用麥?zhǔn)舷x(chóng)卵計(jì)數(shù)法(McMaster's法)計(jì)算每克糞便卵囊數(shù)(Oocysts per gramme，OPG)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(球蟲(chóng)感染第8天)，每組存活雞逐只稱(chēng)重后，全部撲殺，剖檢記錄盲腸病變值，同時(shí)，收集各組盲腸內(nèi)容物及粘膜上皮組織，進(jìn)行盲腸內(nèi)容物稱(chēng)重及盲腸卵囊數(shù)量檢測(cè)等。

1.4.3 藥物療效評(píng)定指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)雞稱(chēng)重分別于感染前和試驗(yàn)結(jié)束逐只稱(chēng)量雛雞體重。按以下公式計(jì)算相對(duì)增重率。增重率=(試驗(yàn)結(jié)束后平均體重-試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的平均體重)/試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的平均體重×100%，相對(duì)增重率=(感染試驗(yàn)組的平均增重÷健康對(duì)照組平均增重)×100%

存活率：存活率(%)=(存活雞只數(shù)/開(kāi)始雞只數(shù))×100%。

病變記分：試驗(yàn)期間每日觀(guān)察各組雞的精神、食欲、糞便、死亡等情況，并記錄結(jié)果，對(duì)試驗(yàn)期間死亡的雞進(jìn)行尸體解剖。參考Johnson & Reid(1970)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，根據(jù)剖檢后腸道病變的嚴(yán)重程度對(duì)每組雞盲腸進(jìn)行病變計(jì)分。病變記分在0～4+范圍之內(nèi)，0表示無(wú)肉眼病變；4+表示最嚴(yán)重病變，盲腸出血嚴(yán)重，高度腫脹，腸腔內(nèi)充滿(mǎn)凝血及黏膜碎片。試驗(yàn)中因球蟲(chóng)病死亡的雞只，其腸道病變記分均記為4分。病變值：每組雞的平均病變記分×10。

血便記分：參照Morehouse和Baron(1970)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[7,9]，非正常糞便記分在0～4+范圍之內(nèi)，0表示未見(jiàn)異常，糞便不帶血；4+表示最嚴(yán)重的異常稀糞，糞便中帶有血液和黏液。

卵囊值[7,10]：按角田清(1986)方法計(jì)算，以感染對(duì)照組的卵囊量為100%(40分)，卵囊比數(shù)為0～1%(卵囊值記為0)；卵囊比數(shù)為1%～25%(卵囊值記為5)；卵囊比數(shù)為26%～50%(卵囊值記為10)；卵囊比數(shù)為51%～75%(卵囊值記為20)；卵囊比數(shù)為76%～100%(卵囊值記為40)。卵囊值=(試驗(yàn)組卵囊/感染對(duì)照組卵囊)×100%。

效果判定：根據(jù)各組試驗(yàn)雞的相對(duì)增重率、存活率、病變值和卵囊值，按美國(guó)Merck公司的方法，計(jì)算抗球蟲(chóng)指數(shù)(Anticoccidial index, ACI)[7]。以ACI為標(biāo)準(zhǔn)判定藥物療效，ACI≤120為無(wú)效；ACI介于120～160為低效；ACI介于160～180為中效；ACI>180為高效。ACI=(相對(duì)增重率+存活率)×100-(病變值+卵囊值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀及血便情況 接種球蟲(chóng)后第3天，除健康對(duì)照組雞只外，其他感染試驗(yàn)組雞只均表現(xiàn)出不同程度的臨床癥狀，如采食量減少、羽毛蓬亂、兩翼下垂、縮頭縮頸、閉眼昏睡、不愿走動(dòng)、離群呆立、排血便等情況。

接種球蟲(chóng)后第4天和第5天，除健康對(duì)照組糞便記分為0外，感染對(duì)照組雞只仍表現(xiàn)排出大量血便癥狀(糞便記分為4)，所有藥物劑量組的雞只其血便明顯減少，精神狀況和采食量出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)跡象(糞便記分為3)。

2.2 病理解剖學(xué)變化 病理解剖發(fā)現(xiàn)，所有健康對(duì)照組試驗(yàn)雞只，其臟器均正常。感染對(duì)照組試驗(yàn)雞只，盲腸和十二指腸顯著腫脹，內(nèi)含大量血樣內(nèi)容物。所有藥物劑量組試驗(yàn)雞只，盲腸及十二指腸亦出現(xiàn)腫脹、血樣性?xún)?nèi)容物，但病變程度較感染對(duì)照組明顯減輕，其他臟器未見(jiàn)明顯眼觀(guān)病變。病變值見(jiàn)表1。

2.3 抗球蟲(chóng)及促生長(zhǎng)效果 通過(guò)相對(duì)增重率、存活率、卵囊值和病變值等指標(biāo)計(jì)算ACI，由表1可知，常山口服液各藥物劑量組的ACI值分別為87.7、136.2、141.8、136.2、109.7和108.0，均高于感染對(duì)照組；常山口服液按5.0、15.0和25.0 mL/L水的劑量飲水給藥，其ACI值均高于妥曲珠利藥物組(ACI值為124.8)。用藥各組雞(除2.5 mL/L藥物劑量組外)增重明顯高于感染對(duì)照組，其中以15.0 mL/L藥物劑量組雞增重最快，比對(duì)照藥妥曲珠利組雞高12.5%。

表1 常山口服液抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)療效試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Curative effect on anticoccidial of Radix dichroa oral liquid (RDOL) to E.tenella in chickens

3 討 論

球蟲(chóng)病是危害極大、呈全球性分布的禽類(lèi)傳染病之一，可導(dǎo)致家禽生長(zhǎng)受阻、飼料轉(zhuǎn)化率降低和肉蛋品質(zhì)下降。在所有的雞球蟲(chóng)屬中，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)對(duì)雞危害最為嚴(yán)重[11]。目前，國(guó)內(nèi)外主要利用化學(xué)合成藥物來(lái)預(yù)防和治療雞球蟲(chóng)病，如地克珠利、妥曲珠利和常山酮等，對(duì)上述藥物的抗球蟲(chóng)作用及機(jī)理研究較多[12]。

中藥和化學(xué)合成藥物在防治球蟲(chóng)病的過(guò)程中，由于來(lái)源不同，其作用效果、作用機(jī)制和治病理論存在很大差別，在防治疾病過(guò)程中中藥一般表現(xiàn)多靶點(diǎn)、多途徑和協(xié)同作用的特點(diǎn)。按照中獸醫(yī)辨證施治理論，雞球蟲(chóng)病為外感濕熱，濕熱蘊(yùn)集大腸，熱毒迫血妄行，導(dǎo)致糞便帶血，濕困脾土，致使雞群下痢，其治療原則應(yīng)以清熱燥濕、涼血止痢為主。中藥常山是我國(guó)著名的截瘧祛痰藥，中醫(yī)主要用于抗瘧疾和退熱藥物使用[13]。研究表明，由常山中分離提取出的常山堿具有良好的抗球蟲(chóng)效果，其作為一種新型的ATP依賴(lài)性抑制劑所具有的定向捕獲作用可能也適用于人類(lèi)其他tRNA合成酶，這一重大發(fā)現(xiàn)揭示了常山堿及其衍生物發(fā)揮抗瘧疾、抗球蟲(chóng)等生物學(xué)功效的可能作用機(jī)理[14]。前期藥理試驗(yàn)證實(shí)，純度為0.24%的常山堿提取物按照0.1 g/kg的劑量飼料拌服給藥，對(duì)人工感染雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)發(fā)病的試驗(yàn)雞只具有良好的治療效果；免疫學(xué)試驗(yàn)表明，常山堿可顯著促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)和巨噬細(xì)胞的免疫功能；毒理學(xué)試驗(yàn)表明，常山提取物毒性較低，臨床用藥安全可靠[15]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，常山口服液按5.0、15.0和25.0 mL/L水劑量飲水給藥，可以提高試驗(yàn)雞只的增重率，對(duì)人工感染E.tenella的發(fā)病試驗(yàn)雞只具有良好的治療效果。但本次試驗(yàn)所有給藥組的ACI值均低于160，可能與所用蟲(chóng)株的毒力有關(guān)。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)廣東株自上世紀(jì)90年代中期分離得到，蔡建平研究員課題組長(zhǎng)期以此蟲(chóng)株進(jìn)行雞球蟲(chóng)病的研究[16]，此蟲(chóng)株毒力較強(qiáng)，每只雞經(jīng)口感染7萬(wàn)個(gè)新鮮孢子化卵囊(1個(gè)月內(nèi))，死亡率介于10%～20%。通常在藥物抗球蟲(chóng)療效試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，感染對(duì)照組(攻蟲(chóng)不給藥)以5～10%的死亡率為最佳，然而此次試驗(yàn)中，設(shè)計(jì)的攻蟲(chóng)劑量為7×104個(gè)孢子化卵囊，感染對(duì)照組的死亡率達(dá)到30%，說(shuō)明實(shí)際攻蟲(chóng)劑量偏大。盡管此次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果中對(duì)照藥物和試驗(yàn)藥物的ACI值都偏低，但仍可從結(jié)果中獲得劑量與抗球蟲(chóng)效果之間的關(guān)系，即常山口服液按5.0、15.0和25.0 mL/L水劑量，飲水給藥，具有良好的抗球蟲(chóng)效果。結(jié)合臨床用藥成本，我們確定常山口服液的最低有效給藥劑量為5.0 mL/L水。

通過(guò)抗球蟲(chóng)療效觀(guān)察試驗(yàn)，結(jié)果提示，人工感染條件下，常山口服液能有效預(yù)防雞球蟲(chóng)病，較化學(xué)藥物妥曲珠利具有更好的抗球蟲(chóng)療效和促生長(zhǎng)作用，且作為中藥提取物，使用安全范圍大，療效對(duì)比試驗(yàn)效果理想，有望成為新型抗球蟲(chóng)藥物。

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