張子?xùn)| 張圓圓 孟永斌 徐 蕾 賈 楠 項(xiàng)鳳影 路 祺

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

沙棗林分布在內(nèi)陸河岸，呈疏林狀態(tài)，分布面積廣泛，僅在額濟(jì)納河西河林區(qū)的沙棗林將近47平方公里。人造的沙棗林大都分布在新疆、陜西、甘肅、寧夏、青海和內(nèi)蒙古等地區(qū)。沙棗果肉含有多糖、脂肪、蛋白質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分，可生食或熟食，還可以用做釀酒、醋、果醬、糕點(diǎn)等[1]。此外，沙棗入藥在民間已經(jīng)有悠久歷史，主治燒傷、腸炎腹瀉、脾胃虛弱、支氣管炎等[2]。雖然沙棗極具生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益，但目前對沙棗的開發(fā)和利用也只局限在初級(jí)加工階段，絕大多數(shù)的沙棗果資源被廢棄，造成了巨大的資源浪費(fèi)。

近些年來，人們發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有抗氧化[3]、抗癌抗腫瘤[4～5]、抗炎[6]、抗心腦血管疾病[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、抑菌抗病毒[9]、降血糖降血脂等作用[10]，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，已成為國內(nèi)外天然藥物開發(fā)利用研究的熱點(diǎn)。常用的植物黃酮類化合物分離和純化方法有柱層析、樹脂吸附、高效液相色譜等[12～13]，其中樹脂吸附法具有表面積大、吸附容量大、選擇性好、預(yù)處理和再生比較容易、解吸條件溫和、樹脂使用周期長、運(yùn)行成本較低等優(yōu)點(diǎn)[14～16]，己被廣泛用于黃酮類化合物的富集。

本研究采用大孔吸附樹脂法對沙棗果總黃酮粗提物進(jìn)行富集，對不同類型的大孔吸附樹脂進(jìn)行靜態(tài)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，從而確定沙棗果總黃酮粗提物最優(yōu)純化工藝，為沙棗果總黃酮的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉均為分析純，購于科密歐化學(xué)試劑廠；金絲桃苷(標(biāo)準(zhǔn)品)，Sigma公司；色譜甲醇(MERK)；自制超純水；D101型、HPD417型、HPD700型、HPD400A型、AB-8型、NKA-Ⅱ型、HPD600型、ADS17型、HPD80型大孔吸附樹脂，均購于滄州寶恩公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)，購于躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；勻漿萃取裝置，購于飛利浦公司；717型自動(dòng)進(jìn)樣高效液相色譜儀，包括1525二元泵和2487型紫外光檢測器，購于美國WATERS公司；美國迪馬色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；3K-30型離心機(jī)，購于Sigma公司；BS124S電子天平，購于北京賽多利斯有限公司；PHS-3B型pH計(jì)，購于精密科學(xué)儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 沙棗果總黃酮提取

取新鮮的沙棗果10 g，按1∶30(m∶V，g∶mL)比例加入55%乙醇溶液，室溫勻漿提取5 min后，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液。2次勻漿提取，合并上清液，負(fù)壓濃縮后60℃干燥得到沙棗果總黃酮。

2.2 總黃酮含量測定

將樣品用蒸餾水溶解，稀釋一定倍數(shù)后，取0.5 mL溶液置于比色管中，加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉，0.5 mL 10%硝酸鋁，4.0 mL 4%氫氧化鈉和4.5 mL 95%乙醇，混勻避光靜止15 min，在510 nm波長下檢定樣品溶液的吸光值。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶于5 mL甲醇，配置濃度1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白樣品以蒸餾水代替樣品。通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算樣品的總黃酮含量，計(jì)算公式如下式：

(1)

式中：y代表總黃酮含量(%)；c代表樣品濃度(mg·mL-1)；v代表樣品液體總體積(mL)；m代表樣品質(zhì)量(mg)[11]。

2.3 大孔樹脂處理

大孔樹脂按料液比為1∶4(m∶V,g∶mL)用蒸餾水浸泡24 h，過濾后按料液比為1∶4(m∶V,g∶mL)加入75%乙醇浸泡24 h，過濾再用蒸餾水洗滌至無渾濁，并且無醇味為止[17～19]。

2.4 大孔樹脂的靜態(tài)吸附、解吸實(shí)驗(yàn)

2.4.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附量測定

取不同型號(hào)的樹脂1.0 g，置于體積為100 mL的錐形瓶中，加入25 mL沙棗果總黃酮溶液，于25℃恒溫水浴振蕩器中100 r·min-1水浴震蕩24 h后，測定錐形瓶內(nèi)液體總黃酮濃度，大孔樹脂吸附量(Q)與吸附率(A)計(jì)算公式如下：

(2)

式中：Q代表大孔樹脂吸附量(mg·g-1)；c0代表靜態(tài)吸附前總黃酮濃度(mg·mL-1)；c1代表靜態(tài)吸附后總黃酮濃度(mg·mL-1)；v代表液體體積(mL)；m代表樹脂質(zhì)量(g)。

(3)

式中：A代表吸附率(%)；c0代表靜態(tài)吸附前總黃酮濃度(mg·mL-1)；c1代表靜態(tài)吸附后總黃酮濃度(mg·mL-1)[20]。

2.4.2 大孔樹脂靜態(tài)解吸量測定

將吸附后樹脂迅速置于體積為100 mL的錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，25℃，100 r·min-1恒溫水浴震蕩24 h，測定錐形瓶內(nèi)總黃酮濃度，解吸率(D)計(jì)算公式見式：

(4)

式中：D代表解吸率(%)；v代表加入乙醇體積(mL)；c代表解吸后錐形瓶中液體總黃酮濃度(mg·mL-1)；m代表樹脂質(zhì)量(g)；Q代表吸附量(mg·g-1)[21]。

2.5 靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線

2.5.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

分別取1.0 g大孔吸附樹脂，置于250 mL錐形瓶中，加入90 mL初始濃度為1.42 mg·mL-1的沙棗果總黃酮提取液，25℃ 100 r·min-1恒溫水浴振蕩，分別于15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min、24 h測定上清液總黃酮濃度，時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)，繪制大孔樹脂對沙棗果總黃酮的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

2.5.2 靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線

靜態(tài)吸附完畢的樹脂用蒸餾水快速地沖洗，除去大孔樹脂表面的殘留液體。將樹脂置于250 mL錐形瓶中，加入70%乙醇90 mL，25℃ 100 r·min-1恒溫水浴震蕩，分別于15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min、24 h取樣測定上清液總黃酮濃度，時(shí)間為橫坐標(biāo)，解吸率為縱坐標(biāo)，繪制大孔樹脂對沙棗果總黃酮的靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線。

2.6 大孔樹脂動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)

2.6.1 樣品濃度對大孔樹脂吸附影響

取大孔樹脂6.0 g，采用濕法裝柱，將總黃酮濃度分別為0.97、2.43、4.15、6.22 mg·mL-1的樣品溶液以2 BV·h-1的流速加入到樹脂柱中，每10 mL收集一管流出液，測定吸光度，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)后停止實(shí)驗(yàn)。

2.6.2 樣品流速對大孔樹脂吸附影響

稱取樹脂6.0 g，采用濕法裝柱，總黃酮濃度為2.43 mg·mL-1的樣品溶液分別以1、2、3 BV·h-1不同流速加入樹脂柱中，每10 mL收集一管總黃酮流出液，測定吸光度，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)后則停止實(shí)驗(yàn)。

2.6.3 洗脫液濃度對大孔樹脂解吸影響

總黃酮濃度為2.43 mg·mL-1樣品溶液以2 BV·h-1的速率通過樹脂柱，達(dá)到泄漏點(diǎn)后停止上樣，用不同濃度梯度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速為1 BV·h-1，每10 mL收集一管流出液，測定吸光度。繪制40%、50%、60%、70%、80%、90%不同濃度乙醇溶液的洗脫曲線。

2.6.4 洗脫速率對大孔樹脂解吸影響

總黃酮濃度為2.43 mg·mL-1樣品溶液以2 BV·h-1的速率通過樹脂柱，吸附達(dá)到泄漏點(diǎn)后，用70%的乙醇溶液洗脫，每10 mL收集一管流出液，測定吸光度，繪制不同流速1、2、3 BV·h-1下的洗脫曲線。

2.7 HPLC分析

色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相：甲醇與0.2%磷酸水溶液比例為45∶55；檢測波長360 nm。

標(biāo)準(zhǔn)品的配制：準(zhǔn)確稱取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇定容至5 mL，配置成濃度1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，從中取1 mL儲(chǔ)備液加入1 mL甲醇，依次稀釋成0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg·mL-1不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測。每樣重復(fù)3次，峰面積取平均值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將沙棗果總黃酮提取液富集前后樣品凍干，分別配置成一定濃度，按照上述HPLC液相條件，測定金絲桃苷含量。

2.8 紅外光譜分析

將2.0 mg沙棗果總黃酮提取物與200 mg溴化鉀(KBr)混勻，經(jīng)瑪瑙研缽研磨后壓片，采用美國Nicolet公司的MAGNA-IR560 E.S.P型紅外光譜儀(掃描范圍4 000～400 cm-1)進(jìn)行紅外光譜測定[22]。

3 結(jié)果與討論

3.1 大孔樹脂的篩選

3.1.1 靜態(tài)實(shí)驗(yàn)

由圖1可知，在9種大孔樹脂中，吸附量和解吸率的乘積最高的3種樹脂分別為D101、AB-8和NKA-Ⅱ，所以選擇以上3種大孔樹脂進(jìn)行下一步沙棗果總黃酮靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線實(shí)驗(yàn)。

圖1 9種大孔吸附樹脂對沙棗果總黃酮的靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果Fig.1 Adsorption and desorption of nine different macroporous resins on Elaeagnus angustifolia fruit flavones

3.1.2 靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線

由圖2可知，AB-8和D101兩種大孔樹脂均在120 min達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，屬于快速平衡類型，而NKA-Ⅱ在180 min達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，較前兩種樹脂稍慢一些。由圖3可知，AB-8、D101和NKA-Ⅱ均在30 min達(dá)到最大解吸狀態(tài)。綜上所述，AB-8型大孔樹脂的吸附量和解吸率均較高，且AB-8型大孔樹脂的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)較好，所以選擇AB-8型樹脂進(jìn)行沙棗果總黃酮的富集。

圖2 3種大孔樹脂吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Adsorption curves of three kinds of macroporous resin

圖3 3種大孔樹脂解吸動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Desorption curves of three kinds of macroporous resin

圖4 樣品濃度對樹脂吸附作用的影響Fig.4 Influence of sample concentration on adsorption

圖5 上樣流速對樹脂吸附作用的影響Fig.5 Influence of sample speed on adsorption

3.2 AB-8型大孔樹脂對沙棗果總黃酮的富集條件優(yōu)化

3.2.1 樣品濃度對沙棗果總黃酮的富集影響

由圖4可知，樣品總黃酮濃度分別為0.97、2.43、4.15、6.22 mg·mL-1到達(dá)泄露點(diǎn)時(shí)的總體積為130、80、20、10 mL，即逐漸加快。當(dāng)樣品濃度過大時(shí)，液體中的有效成分不能高效吸收而流出；當(dāng)樣品濃度過低時(shí)，液體中有效成分少，導(dǎo)致樹脂未能很好的利用。由此，選擇2.43 mg·mL-1比較適宜。

3.2.2 上樣速率

由圖5可知，上樣速率1、2、3 BV·h-1到達(dá)泄露點(diǎn)時(shí)的體積為110、80、40 mL，即逐漸加快。當(dāng)上樣濃度一定時(shí)，上樣流速過快，液體與樹脂之間接觸不充分，導(dǎo)致樹脂吸附能力下降；而上樣流速過慢，影響處理效率。由此，選擇2 BV·h-1比較適宜。

3.2.3 乙醇濃度

由圖6可知，洗脫物質(zhì)大多集中在20～60 mL，當(dāng)乙醇濃度小于70%時(shí)，隨著乙醇濃度增加洗脫物質(zhì)集中程度變高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)達(dá)到最大。因此，選擇70%乙醇濃度作為洗脫液濃度。

3.2.4 洗脫速率

由圖7可知，當(dāng)洗脫速度為2 BV·h-1時(shí)，洗脫的物質(zhì)最集中。由此，選擇2 BV·h-1為洗脫速率。

圖6 乙醇濃度對樹脂解吸作用的影響Fig.6 Influence of ethanol concentration on desorption

圖7 洗脫速率對樹脂解吸作用的影響Fig.7 Influence of ethanol speed on desorption

3.3 總黃酮富集前后HPLC比較

由圖8可知，金絲桃苷在15.18 min出峰，金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.743 9×105x+6 923，其中R2=0.999 4，x代表樣品濃度，y代表樣品積封面積。在0.031 25～0.5 mg·mL-1相關(guān)性良好。

由圖9可知，沙棗果總黃酮富集前后樣品與金絲桃苷的出峰時(shí)間一致，說明沙棗果總黃酮富集前后樣品中均含有金絲桃苷類化合物，并且富集后的沙棗果總黃酮純度明顯增加。

圖8 金絲桃苷標(biāo)品高效液相色譜分析圖Fig.8 High performance liquid chromatography of hyperoside standard

圖9 沙棗果總黃酮富集前后樣品高效液相色譜分析圖 A.金絲桃苷(標(biāo)準(zhǔn)品)；B.沙棗果總黃酮富集后樣品；C.沙棗果總黃酮富集前樣品Fig.9 High performance liquid chromatography of E.angustifolia fruit samples before and after purification A.Hyperoside(standard)；B.E.angustifolia flavonoids after enrichment；C.E.angustifolia flavonoids before enrichment

由圖10可知，按照以上最優(yōu)的沙棗果總黃酮富集條件，所得沙棗果總黃酮純度由富集前的9.73%增加到富集后的49.52%，純度提高5.09倍；沙棗果總黃酮富集前樣品中金絲桃苷的純度為0.53%，沙棗果富集后樣品金絲桃苷純度為3.07%，比富集前提高5.79倍。

圖10 沙棗果總黃酮富集前后總黃酮及金絲桃苷純度變化Fig.10 The purity comparison of total flavonoids and hyperoside from E.angustifolia fruit before and after purification

3.4 沙棗果總黃酮富集前后結(jié)構(gòu)表征

圖11為沙棗果總黃酮富集前樣品、富集后樣品及金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的紅外圖譜，可以看出有以下特征吸收峰：在3 415 cm-1附近出現(xiàn)O—H的伸縮振動(dòng)；在3 000～2 800 cm-1范圍主要為C—H的伸縮振動(dòng)，在2 500～1 900 cm-1范圍屬于叁鍵和累計(jì)雙鍵區(qū)，但是沙棗果總黃酮富集前后樣品在該波段沒有出現(xiàn)峰值。由此可推測，沙棗果總黃酮類化合物不含有反對稱伸縮振動(dòng)的官能團(tuán)，例如—C≡C—、—C≡N、—C=C=C—、—C=C=O等；1 735.17 cm-1處的吸收峰是由C=O引起；1 518.48 cm-1為芳環(huán)振動(dòng)引起吸收峰；在900～890 cm-1有吸收峰，說明沙棗果總黃酮類化合物中含有β-糖苷鍵[23～29]。由此，可推斷沙棗果總黃酮類化合物是以糖苷類形式成在。

圖11 沙棗果總黃酮富集前后樣品紅外光譜圖 A.沙棗果總黃酮富集前樣品；B.沙棗果總黃酮富集后樣品；C.金絲桃苷(標(biāo)準(zhǔn)品)Fig.11 FTIR of Elaeagnus angustifolia fruit samples before and after purification A.Sample of total flavonoids before enrichment；B.Sample of total flavonoids after enrichment；C.Hyperoside(standard)

4 結(jié)論

本研究通過對9種不同型號(hào)的大孔樹脂進(jìn)行靜態(tài)篩選，從中選出3種吸附和解吸效果較好的大孔樹脂，分別是AB-8型、D101型、NKA-Ⅱ型。通過對這3種大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線分析，最終確定AB-8型大孔樹脂用于沙棗果總黃酮類化合物的富集；通過AB-8型進(jìn)行大孔樹脂動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)富集條件為樣品濃度2.43 mg·mL-1，上樣速率2 BV·h-1，乙醇濃度70%，洗脫速率2 BV·h-1，所得到的沙棗果總黃酮純度由富集前的9.73%增加到富集后的49.52%，純度提高5.09倍。金絲桃苷含量由富集前的0.53%增加到富集后的3.07%，純度提高了5.79倍；通過對沙棗果總黃酮富集前后樣品的紅外結(jié)構(gòu)表征，可以看出沙棗果總黃酮富集前后樣品和金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品均含有黃酮類特征峰。

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