張 強(qiáng) 劉 一 吳曉敏 束良佐 宋運(yùn)賢 陳 楚 龍民慧*

(1.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/信息學(xué)院，淮北 235000； 2.資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮北 235000)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)是我國特有的葡萄科(Vitaceae)崖爬藤屬(Tetrastigma)珍稀藥用植物。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，它具有抗炎、鎮(zhèn)痛與解熱、抗病毒、保肝等作用[1～5]。臨床上以地下塊根或全草入藥，廣泛用于抗癌、抗腫瘤及抗艾滋病毒等疾病[6～8]。三葉青的提取物中含有多種藥用活性成分。目前已經(jīng)鑒定出的化學(xué)成分有黃酮、黃酮苷、淀粉、還原糖、甾類化合物、油脂以及氨基酸等多種成分[9～11]。其中重要的生理活性物質(zhì)有黃酮類和黃酮苷類，如原花青素B1、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、異槲皮苷和山柰酚等[12]。

氮素作為植物最重要的營養(yǎng)元素之一，對植物的生長發(fā)育起著非常重要的作用，是葉綠素的主要成分之一，也是蛋白質(zhì)、核酸等重要生命物質(zhì)的構(gòu)成元素，同時(shí)亦可以影響植物次生代謝物質(zhì)的積累。已有研究證實(shí)氮素可直接或間接地影響植物體內(nèi)黃酮類化合物等次生代謝產(chǎn)物的合成，并且還發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)氮肥對黃酮類化合物的合成影響差異顯著[13～16]。黃酮類化合物的合成途徑主要通過苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸4-羥基化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL)等酶催化下將苯丙氨酸催化成4-香豆酰CoA(4-coumaroyl-CoA)[17]。然后，丙二酰CoA和對香豆酰-CoA在查爾酮合成酶(CHS)的催化下反應(yīng)生成第一個(gè)具有C15基本骨架的黃酮類化合物-查爾酮，合成查爾酮之后，它再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化和生成各種黃酮類化合物[18]。PAL酶催化苯丙氨酸生成肉桂酸和香豆酸等物質(zhì)，是連接苯丙烷化合物和初級代謝的關(guān)鍵酶，對于調(diào)節(jié)黃酮類化合物合成具有重要的作用，同時(shí)CHS酶是催化形成黃酮基本骨架的主要催化酶。氮元素能夠通過PAL和CHS來對植物黃酮類化合物的合成進(jìn)行影響，但不同植物種類和不同的氮形態(tài)影響均不一致。然而，氮素及其不同形態(tài)是否通過PAL和CHS影響植物體內(nèi)黃酮類化合物的生物合成及相關(guān)機(jī)制目前還鮮見報(bào)道。因此，了解氮素對三葉青生長及黃酮類化合物生物合成的影響有利于三葉青的栽培和推廣，從而進(jìn)一步有效提高三葉青的利用價(jià)值。

本研究通過盆栽控制試驗(yàn)，比較研究不同形態(tài)氮肥對三葉青黃酮類化合物的積累以及氮同化的影響，并研究不同氮形態(tài)對黃酮類化合物累積關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控，以期為三葉青進(jìn)一步的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)，并對推動(dòng)三葉青的應(yīng)用推廣具有重要意義。

1 材料方法

1.1 供試材料

盆栽試驗(yàn)于2015年3月～2016年8月在安徽省淮北市郊區(qū)試驗(yàn)基地(租賃)內(nèi)進(jìn)行，供試三葉青植株由浙江省磐安縣紫騰三葉青專業(yè)合作社提供。供試土壤為壤土，取自淮北農(nóng)田，采樣深度為表層20 cm，土壤pH值為7.2，W(有機(jī)質(zhì))為2.62%，W(總氮)為1.35 g·kg-1，W(總磷)為0.72 g·kg-1，W(堿解氮)為76.84 mg·kg-1，W(速效磷)為36.86 mg·kg-1，W(速效鉀)為73.76 mg·kg-1，陽離子交換量為6.54 cmol·kg-1，該土壤與草木灰按照4∶1的比例混合均勻裝盆。氮肥為銨態(tài)氮肥[(NH4)2SO4]和硝態(tài)氮肥[NaNO3]，不含結(jié)晶水，均為分析純；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和QPCR mix試劑盒購自Thermo Fisher公司(美國)，PAL和CHS活性檢測試劑盒購自北京致力生科科技有限公司(中國)。PAL elisa檢測試劑盒購自江萊生物科技有限公司(中國)、CHS抗體購自Agrisera公司(瑞典)，其余化學(xué)試劑均購自Sigma公司(美國)。

1.2 三葉青的處理

1.3 PAL特異性抑制劑(AOA)處理

使用PAL特異性抑制劑(AOA)濃度為200 Umol·L-1的水50 mL澆入銨態(tài)氮和硝態(tài)氮處理后的三葉青根部，每3天1次，共10次，與銨態(tài)氮處理和硝態(tài)氮處理作為對照(CK)。

1.4 樣品處理與黃酮類成分含量測定

將新鮮的植物樣品用自來水清洗后再用去離子水清洗干凈，然后將三葉青植株分為莖、葉和主根3個(gè)部位。每個(gè)處理取6株三葉青樣品在105℃殺青30 min，然后70℃烘干至恒重，待冷卻后磨碎待用。測定葉和主根部位的原花青素B1、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、異槲皮苷和山柰酚等黃酮類化合物的含量。精密稱取原花青素B1、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、異槲皮苷、山柰酚，加甲醇分別制成每1 mL含0.5 mg的原花青素B1、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、異槲皮苷、山柰酚甲醇溶液；取樣品粉末0.5 g，加入甲醇50 mL，稱量，放置過夜，置于80℃水浴，放至室溫，再稱量，用甲醇補(bǔ)足，搖勻，過濾，取濾液供試。分別精密吸取對照品溶液與待測樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。

1.5 PAL和CHS提取與活性測定

稱取新鮮植物樣品1.0 g，加入2 mL 100 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH7.5)、2 mL 250 mmol·L-1蔗糖、2 mL 4 mmol·L-1氯化鎂和2 mL 5 mmol·L-1巰基乙醇，冰浴磨成組織勻漿液(10%)。10 000 r·min-1離心10 min，取上清液為酶粗提液。采用PAL和CHS酶試劑盒進(jìn)行測試，酶標(biāo)儀測定酶活性。PAL和CHS酶活性的單位用U·g-1表示。

1.6 QPCR檢測CHS和PLA的轉(zhuǎn)錄

采用QIAGEN的植物RNA提取試劑盒RNeasy Plant Mini Kit提取三葉青根部和葉片的總RNA，用微量紫外分光光度計(jì)(Merinton,美國)對RNA的濃度及純度進(jìn)行檢測。利用Thermo公司提供的cDNA試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，并將質(zhì)量濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng·mL-1。PAL、CHS基因(無相關(guān)序列信息)引物參照葡萄科葡萄的引物序列，以葡萄科葡萄的基因GHPDH為內(nèi)參，引物序列如表1所示，委托北京致力生科科技有限公司合成。熒光定量PCR使用Life technologies的QPCR mix體系在Life 7500 QPCR儀上進(jìn)行。50 μL的體系，上下游引物各1 μL，QPCR mix 25 μL，cDNA為2 μL，用去離子水補(bǔ)足到50 μL。PCR的條件如下：95攝氏度預(yù)變性10 min，95攝氏度變性45秒，54攝氏度退火30秒，72攝氏度延生1分鐘，總共40個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列信息

1.7 ELISA和WB分別檢測PLA、CHS的表達(dá)情況

植物蛋白的制備依據(jù)北京致力生科科技有限公司植物蛋白提取試劑盒進(jìn)行，PLA表達(dá)量檢測根據(jù)江萊生物PLA檢測試劑盒說明書進(jìn)行，所有檢測重復(fù)3次，數(shù)值讀取運(yùn)用美國AWARENESS酶標(biāo)儀進(jìn)行。將制備好的蛋白在12%的SDS-PAGE進(jìn)行分離(儀器為美國伯樂公司電泳設(shè)備)，利用伯樂半干轉(zhuǎn)移設(shè)備將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Roche)。PVDF膜用5%脫脂奶粉的TBST中在4℃冰箱進(jìn)行封閉12 h。TBST將封閉好的PVDF膜洗滌3次，每次5 min。用5%脫脂奶粉稀釋一抗CHS，一抗的稀釋比例為(1∶1 000)，PVDF膜與稀釋后的一抗在常溫下進(jìn)行孵育2 h，然后TBST洗滌膜3次，每次5 min；然后用辣根標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶100在5%脫脂奶粉的TBST，購自北京致力生科科技有限公司)進(jìn)行雜交，TBST洗滌3次，每次5 min。然后在柯達(dá)膠片上進(jìn)行曝光，發(fā)光液等購自Thermo公司。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、分析和作圖均采用SPSS 23.0(SPSS,Chicago,IL)和SigmaPlot 12.5(Systat Software,San Jose,CA,USA)軟件完成。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 高效液相色譜測定三葉青黃酮類活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.4節(jié)的測定結(jié)果，使用高效液相色譜測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，求得原花青素B1、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、異槲皮苷和山柰酚的回歸方程分別為Y=5.401 2X，R2=0.999 2；Y=3.094 5X，R2=0.999 8；Y=12.247 0X，R2=1.000 0；Y=4.711 8X，R2=1.000 0；Y=10.532 0X，R2=0.999 3和Y=1.741 2X，R2=0.997 1，說明具有良好的線性關(guān)系，因此原花青素B1、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、異槲皮苷和山柰酚質(zhì)量濃度在上述橫坐標(biāo)數(shù)值范圍內(nèi)，就可以根據(jù)這些方程進(jìn)行定量分析。

2.2 不同氮形態(tài)對三葉青中黃酮類累積的影響

圖2 不同形態(tài)氮素處理對三葉青根和葉中黃酮類化合物含量的影響 *，**分別代表不同處理之間差異達(dá)到顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01) 下同。Fig.2 Effects of different nitrogen forms on the flavonoids contents in the roots and leaves of T.hemsleyanum * and ** indicate the difference at significant (P<0.05) or extremely significant(P<0.01) level between treatments,respectively.The same as below.

圖4 不同氮素形態(tài)處理對三葉青根和葉中的PAL和CHS基因表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of different nitrogen forms on the expression level of PAL and CHS genes in the roots and leaves of T.hemsleyanum

2.3 不同氮形態(tài)對三葉青根中PAL和CHS轉(zhuǎn)錄的影響

2.4 不同氮形態(tài)對三葉青PAL和CHS表達(dá)量的影響

圖5 不同氮素形態(tài)處理對三葉青根和葉中的PAL和CHS酶活性的影響Fig.5 Effects of different nitrogen forms on the activities of PAL and CHS enzymes in the roots and leaves of T.hemsleyanum

2.5 不同氮形態(tài)對三葉青PAL和CHS酶活性的影響

2.6 AOA對不同氮形態(tài)處理三葉青PAL和CHS活性及黃酮類化合物積累的影響

表2AOA抑制劑對不同氮形態(tài)處理三葉青中PAL和CHS活性的影響

Table2EffectsofPAL-specificinhibitor(AOA)ontheenzymeactivitiesofPALandCHSinT.hemsleyanumunderdifferentnitrogenformssupply

銨態(tài)氮Ammonium-N supply硝態(tài)氮Nitrate-N supplyPAL特異性抑制劑AOA—PAL特異性抑制劑AOA—PAL酶活性PAL enzyme activity2.99±0.1921.01±2.36??4.09±0.2339.12±4.75??CHS酶活性CHS enzyme activity21.91±0.9920.05±3.8912.51±5.0125.51±5.33??

注：*，**分別代表與AOA處理組相比差異達(dá)到顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)，下同。

Note： * and ** indicate the difference is significant(P<0.05) and very significant(P<0.01) as compared with AOA-treated group,respectively,the same as below.

表3AOA抑制劑對不同氮形態(tài)處理三葉青中黃酮類成分含量的影響

Table3EffectsofPAL-specificinhibitor(AOA)ontheaccumulationofflavonoidssubstancesofT.hemsleyanumunderdifferentnitrogenformssupply

銨態(tài)氮Ammonium-N supply硝態(tài)氮Nitrate-N supplyPAL特異性抑制劑AOA—PAL特異性抑制劑AOA—原花青素B1Procyanidin B143.54±2.88117.56±4.94??50.11±9.54220.01±11.12??蘆丁Rutin34.57±1.61103.21±4.09??52.45±5.01338.61±18.95??山柰酚-3-O-蕓香糖苷Kaempferol-3-O-rutinoside43.65±1.56326.15±51.12??89.54± 9.05532.83±26.78??槲皮素Quercetin28.91±6.34126. 09±7.77??40.08±9.91188.27±12.33??異槲皮苷Isoquercitrin3.28±0.8519.33±1.01??8.77±0.8226.28±7.03??山柰酚Kaempferol6.79±0.9017.19±1.03??8.03±0.8642.91±1.81??

3 討論

三葉青是抗腫瘤常用藥物，也具有抗炎、解熱、護(hù)肝等作用[1～8]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明總黃酮、總氨基酸和多糖為三葉青中主要活性物質(zhì)[9～11]，尤其是黃酮類物質(zhì)是其藥效的主要成分。因此，提高中藥材三葉青體內(nèi)黃酮類物質(zhì)的生物合成是三葉青是三葉青開發(fā)和研究的熱點(diǎn)之一。

圖6 AOA抑制劑對不同氮形態(tài)處理三葉青葉片PAL和CHS活性及黃酮類化合物積累的影響Fig.6 Effects of PAL-specific inhibitor(AOA) on the enzyme activity of PAL and CHS,and flavonoids accumulation in the leaves of T.hemsleyanum under different nitrogen forms supply

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