張瓊 張雪丹 王中堂 周廣芳 單公華

摘要：以‘魯棗1號為試材，采用響應(yīng)面法優(yōu)化棗果三萜酸的提取工藝條件。結(jié)果表明，棗果三萜酸提取最佳工藝為乙醇濃度70%、料液比1∶26、提取溫度65℃、超聲30 min、提取3次，棗果三萜酸含量為0.76 mg/g。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；棗；三萜酸

中圖分類號：S665.109.9文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）04-0120-05

Abstract The response surface method was adopted to optimize the extraction conditions of triterpenic acids from Luzao 1 fruits. The results showed that the optimum conditions were as follows： the concentration of ethanol was 70%， the material-liquid ratio was 1∶26， the extraction temperature was 65℃，the ultrasonic extraction time was 30 min and extracting times were three. The content of triterpenic acids was 0.76 mg/g under such conditions.

Keywords Response surface method； Jujube； Triterpenic acids

棗（Ziziphus jujuba Mill.）是集食用、藥用和保健為一體的傳統(tǒng)滋補(bǔ)佳品和藥食同源果品。棗果中富含多類生物活性物質(zhì)，其中有機(jī)酸含量較高，目前已從棗果中分離鑒定出33種有機(jī)酸，以三萜酸類為主，其次為齊墩果酸、樺木酸、熊果酸等[1-3]。研究表明棗果中的三萜酸能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，降低谷丙轉(zhuǎn)氨酸和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，起到抗腫瘤、保肝作用，同時(shí)具有較強(qiáng)的消炎抑菌作用[3-5]，是棗果中一類重要的生物活性物質(zhì)。中國擁有世界99%的棗樹栽培面積和產(chǎn)量，又是世界唯一的棗出口國，因此棗三萜酸的開發(fā)與利用具有絕對的市場優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景。

安全高效提取是棗三萜酸得以深入開發(fā)與利用的基礎(chǔ)。響應(yīng)面法可以用較少的試驗(yàn)量有效、快速地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件，該方法常用于優(yōu)化食品中各種生物活性物質(zhì)的綜合分離工藝條件[6，7]。因此，本試驗(yàn)以自主選育的棗樹新品種‘魯棗1號為試材，采用響應(yīng)面法優(yōu)化棗三萜酸的提取工藝，以期為棗三萜酸的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)、提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試材料‘魯棗1號為山東省果樹研究所自‘金絲小棗中選育出的極早熟鮮食品種，于2011年通過國家林木品種審定委員會審定。2015年7月，于山東省果樹研究所棗資源圃摘取‘魯棗1號全紅棗果1 kg，帶回實(shí)驗(yàn)室，用清水沖洗干凈，切片，用液氮研磨成粉末狀，放入-20℃冰箱中待用。

乙醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸均為分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國科學(xué)院成都生物研究所提供。

FA135S型電子分析天平、UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品；TH-100BQX型超聲波清洗機(jī)，濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇溶解并定容，得到1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)母液。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL標(biāo)準(zhǔn)母液置于10 mL試管中，沸水浴揮干，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL 和高氯酸0.8 mL，搖勻，60℃水浴15 min，冷卻至室溫，用冰醋酸定容至刻度，混勻，置于550 nm吸光度下進(jìn)行比色，測定其吸光值。以齊墩果酸含量為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過線性擬合得到回歸方程Y=0.0885X+0.0534，R2=0.990 7。

1.3 樣品液的制備與測定

準(zhǔn)確稱取棗粉1 g，置于50 mL三角瓶中，按一定的乙醇濃度、料液比、提取溫度、超聲30 min，提取3次，合并提取液。量取樣品液0.3 mL，置于10 mL試管中，揮干，按1.2步驟進(jìn)行反應(yīng)，在550 nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算棗果中三萜酸含量。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取棗粉1 g，分別固定乙醇濃度為60%、料液比為1∶20、溫度為60℃、提取時(shí)間為30 min中的3個因素，分別考察第4個因素中乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、100%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、提取溫度（40、50、60、70、80℃）、提取時(shí)間（20、30、40、60、90 min）對棗果中三萜酸含量的影響，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對提取效果影響較大的提取溫度（X1）、料液比（X2）、乙醇濃度（X3）三個因素，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法（表1），分析3種因素對棗三萜酸提取工藝的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度對提取效果的影響 由圖1可知，棗果中的三萜酸提取量隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)提取量達(dá)到最大值。100%乙醇提取時(shí)三萜酸含量很低，可能是乙醇濃度越高，溶出的雜質(zhì)越多，與三萜酸競爭乙醇-水分子，從而導(dǎo)致提取率下降[8]。因此，乙醇濃度選定為70%。

2.1.2 料液比對提取效果的影響 由圖2可知，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，三萜酸的提取量最高，再增加提取液的比例，提取量反而降低，可能是采用1∶30的料液比提取時(shí)，提取目的物在提取液中的擴(kuò)散程度已達(dá)到平衡[9]，故確定料液比為1∶30。

2.1.3 提取溫度對提取效果的影響 圖3顯示，隨著溫度的升高，三萜酸的提取量逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，三萜酸的提取量最大并趨于穩(wěn)定。故選擇提取溫度為60℃。

2.1.4 提取時(shí)間對提取效果的影響 由圖4可知，30～60 min之間三萜酸提取量較大，提取時(shí)間對提取量影響不大，之后隨著提取時(shí)間的延長而降低?？赡苁怯捎诔晻r(shí)間的延長，超聲作用強(qiáng)度增加，使其溶出較多的其他成分與三萜酸競爭乙醇-水而導(dǎo)致提取率下降[10]。因此，超聲時(shí)間確定為30 min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立和顯著性測驗(yàn) 利用Central Composite Design設(shè)計(jì)，綜合單因素影響結(jié)果，選取對提取效果影響較大的料液比、乙醇濃度和提取溫度為參數(shù)，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2。

由表3可看出，模型能解釋97.47%響應(yīng)值的變化。調(diào)整決定系數(shù)為0.942 1，說明每兩個因素之間相關(guān)性良好。利用回歸分析得到三萜酸含量對以上3個因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=0.77+0.061X1+0.035X2-0.027X3-0.005X1X2+0.038X1X3-0.012X2X3-0.059X21-0.098X22-78.49X23

試驗(yàn)分析表明，模型整體P值很低（P<0.0001），表明該模型極顯著。失擬項(xiàng)（P>0.05）不顯著，可知二次方程具有很高的擬合度及可信度，試驗(yàn)誤差小，因此可以用此模型對超聲輔助提取棗三萜酸的優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行分析預(yù)測。

2.2.2 響應(yīng)面分析 圖5至圖7直觀反映了任何2個因素交互作用對響應(yīng)值的影響，乙醇濃度、料液比和提取溫度對棗果三萜酸的提取有著極顯著的影響，與表3結(jié)果相吻合。

2.3 最佳提取工藝條件的確定及驗(yàn)證

用Design-Expert V8.0.6軟件得出棗果三萜酸提取的最佳工藝為：提取溫度64.74℃、料液比1∶25.85、乙醇濃度69.53%，棗果三萜酸最佳提取量為0.79 mg/g。結(jié)合實(shí)際操作中的可行性，在檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化棗果三萜酸提取工藝的可靠性時(shí)，將最優(yōu)提取工藝條件修改為：提取溫度65℃、料液比1∶26、乙醇濃度70%。在此條件下，超聲提取棗果三萜酸的提取量為0.76 mg/g，實(shí)際值與理論值基本相符，證明試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽俊?/p>

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化棗果三萜酸超聲提取工藝。利用單因素試驗(yàn)分析了提取液濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間對棗果三萜酸提取率的影響，料液比、提取溫度和提取濃度對棗果三萜酸提取率影響顯著，提取時(shí)間影響不顯著。

利用Design-Expert V8.0.6軟件的中心組合設(shè)計(jì)方法，選取對棗果三萜酸提取率影響顯著的提取液濃度、提取溫度和料液比3個因素，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，建立數(shù)學(xué)模型，結(jié)合響應(yīng)面交互作用分析結(jié)果和實(shí)際可操作性，驗(yàn)證得到棗果三萜酸最佳提取工藝為：乙醇濃度70%、料液比1∶26、提取溫度65℃、超聲30 min，提取3次。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Lee S M， Park J G， Lee Y H. Anti-complementary activity of triterpenosides from fruits of Zizyphus jujuba[J]. Biol.Pharm.Bull.， 2004， 27 （11）： 1883-1886.

[2] Mondal D N， Kundu A B. A-nor-triterpenoid from Zizyphus jujuba[J]. J.Indian Chem.Soc.， 1998， 75 （6）： 384-385.

[3] Su B N， Cuendet M， Farnsworth N R， et al. Activity-guided fractionation of the seeds of Ziziphus jujuba using a cyclooxygenase-2 inhibitory assy[J]. Planta Med.， 2002， 68 （12）： 1125-1128.

[4] 田麗婷，馬龍，堵年生. 齊墩果酸的藥理作用研究概況[J]. 中國中藥雜志，2002， 27（12）：884-886.

[5] Suksamrarn S， Panseeta P， Kunchanawatta S. Ceanothane- and lupane-type triterpenes with antiplasmodial and antimycobacterial activity from isolation of coclaurine from Zizyphus cambodiana[J]. Chem.Pharm.Bull.，2006，54（4）：535-537.

[6] 武中庸，熱孜萬古力·賽買提，車敏娜，等.響應(yīng)面法優(yōu)化紫色馬鈴薯花青素超聲波提取工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，33（6）：1379-1385.

[7] 李童，束成杰，尹永祺，等.響應(yīng)面法優(yōu)化琉璃苣籽油提取工藝及其脂肪酸成分的測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，33（4）：914-920.

[8] 李娜， 但漢龍， 劉云，等. 雀嘴茶中咖啡酰熊果苷提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 44 （6）： 1-8.

[9] 張昊， 邵青， 賀曉龍，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化山丹鱗莖總黃酮提取工藝的研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 45 （3）： 152-156.

[10]胡云峰， 姜曉燕， 崔翰元，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取靈武長棗中三萜類化合物的研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2010， 31（5）： 260-263.