趙 瀅，艾 軍，楊義明，王振興，劉迎雪，何 偉，劉海雙

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112）

0 引 言

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）屬多年生木質(zhì)藤本，是葡萄屬中最抗寒的一個(gè)種[1-2]。休眠期枝條的抗寒性具有較高的遺傳力，是葡萄抗寒育種的重要親本材料[3-4]。但田間觀察發(fā)現(xiàn)不同山葡萄種質(zhì)抗寒能力存在差異，而目前適于山葡萄休眠期枝條抗寒性的鑒定方法尚不夠完善，對(duì)不同山葡萄種質(zhì)資源抗寒差異的了解仍不清晰[5]，影響了抗寒種質(zhì)的進(jìn)一步發(fā)掘與利用。

低溫半致死溫度（LT50）可用來(lái)反映植物的抗寒性，實(shí)驗(yàn)室常用相對(duì)電導(dǎo)率法擬合計(jì)算低溫半致死溫度來(lái)鑒定葡萄屬的抗寒性[6-7]。然而，在實(shí)際測(cè)定中發(fā)現(xiàn)由于溫度、浸泡時(shí)間以及空氣中 CO2的溶解等因素都會(huì)對(duì)實(shí)際測(cè)定的電導(dǎo)值產(chǎn)生影響，造成測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較差[8-10]。而采用隸屬函數(shù)法對(duì)作物抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的結(jié)果較為全面、準(zhǔn)確[11-14]，但對(duì)于大量種質(zhì)抗寒性的篩選則需要尋找更為簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確的鑒定方法。

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法也可用于作物抗寒性鑒定[15-18]，具有直觀且操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但目前關(guān)于TTC染色法測(cè)定枝條組織活力的研究報(bào)道中，均是通過(guò)觀察枝條橫截面剪口著色深淺程度進(jìn)行判定[19]。在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)該方法存在一些不足，主要是染色生成紅色的三苯基甲臢（TTF）經(jīng)常在失去組織活性的枝條橫截面剪口外側(cè)堆積，造成觀測(cè)誤差；另外，枝條橫切面著色深淺程度目測(cè)也難以準(zhǔn)確判斷，需量化。

本研究將以40份山葡萄種質(zhì)1 a生休眠期枝條為試材，對(duì)浸染枝段進(jìn)行縱切，以枝段縱切面染色面積為判斷標(biāo)準(zhǔn)，可避開(kāi)原有TTC染色法橫截面上出現(xiàn)TTF堆積問(wèn)題；同時(shí)探索TTC染色圖像的可視化評(píng)估，以及量化獲得的染色指數(shù)能否配合 Logistic方程在山葡萄抗寒性鑒定上進(jìn)行應(yīng)用，并與隸屬函數(shù)法獲得的綜合抗寒性評(píng)價(jià)結(jié)果及田間鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，以此來(lái)驗(yàn)證這種以枝段縱切面染色面積為判定標(biāo)準(zhǔn)的抗寒性鑒定新方法的可行性和準(zhǔn)確性，以期建立起適于大量山葡萄種質(zhì)休眠期抗寒性鑒定的簡(jiǎn)便、可靠方法，從而判斷不同山葡萄種質(zhì)抗寒性強(qiáng)弱，最終為山葡萄抗寒評(píng)價(jià)研究及抗寒育種材料選擇提供有效鑒定方法和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料采自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)左家山葡萄圃，種質(zhì)圃地處吉林省吉林市左家鎮(zhèn)，位于北緯 44°04′，東經(jīng) 126°05′，海拔190 m。年均氣溫3.6 ℃，絕對(duì)低溫-39.8 ℃。圃地為南向緩坡地，土壤為暗棕森林土。圃中每份資源為扦插繁殖的自根苗，籬架生長(zhǎng)，株行距1.0 m × 2.5 m，柱間距6 m。樹(shù)體肥水管理采用常規(guī)管理模式[20]。40份試材包括純種山葡萄種質(zhì)（V. amurensis）38份，山歐雜種（（V.amurensis×V.vinifera）×V.amurensis）2 份。38 份山葡萄種質(zhì)的休眠期枝條于2017年1月剪取，當(dāng)年1月最低氣溫為-28.2 ℃；山歐雜種‘北冰紅’和‘左優(yōu)紅’為對(duì)照品種，其休眠枝條于深秋10月底未埋土防寒前剪取，然后放入冷庫(kù)中待處理。所用枝條均為長(zhǎng)勢(shì)和粗度相對(duì)一致（約0.8 cm粗）且健康成熟的1年生枝條，架面南側(cè)1.0～1.8 m范圍內(nèi)取樣。每份種質(zhì)取50根枝條，每根60 cm長(zhǎng)。

1.2 材料處理

材料處理參照 Zhang等的方法[21]，略有修改。將采集的枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，剪成20 cm長(zhǎng)的小段，裝于自封袋中，-15 ℃冰箱中貯藏。使用高低溫交變?cè)囼?yàn)箱（型號(hào)：GDJW-225，北京雅士林試驗(yàn)設(shè)備有限公司）對(duì)枝條進(jìn)行低溫處理，處理溫度為-20、-25、-30、-35、-40、-45、-50 ℃，按4.0 ℃/h的速度降溫，至設(shè)定溫度后保持12 h，再按4.0 ℃/h的速度升至20 ℃后，取出靜置2 h。去除表皮，避開(kāi)芽眼，以備用于抗寒性評(píng)價(jià)及指標(biāo)測(cè)定等研究。

1.3 抗寒性的實(shí)驗(yàn)室鑒定

1.3.1 TTC染色圖像可視化評(píng)估鑒定枝條抗寒性

不同低溫處理后，從各枝條上剪取0.5 cm小段，每份種質(zhì)取10段，放入10 mL 0.5 % TTC染液中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光染色4 d后取出，然后將枝段縱切，蒸餾水沖洗 3次，濾紙吸干水分，放入連有 WinRHIZOTM圖像分析軟件的 LA2400掃描儀中對(duì)枝段縱切面進(jìn)行掃描；利用圖像分析軟件計(jì)算縱切面染色面積并確定染色等級(jí)；同時(shí)根據(jù)染色等級(jí)計(jì)算染色指數(shù)，以染色指數(shù)反映各試材的受凍程度。

染色分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下（圖1）：4級(jí)，縱切面90 %以上的面積呈紅色；3級(jí)，縱切面70%～90%的面積呈紅色；2級(jí)，縱切面40%～70%的面積呈紅色；1級(jí)，縱切面5%～40%的面積呈紅色；0級(jí)，縱切面5%以下的面積呈紅色。染色指數(shù)= Σ（染色級(jí)別×枝段數(shù)）/（4×枝段總數(shù)）。

圖1 染色分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Standard of staining identification

根據(jù)不同山葡萄種質(zhì)各低溫處理下枝段染色指數(shù)的變化情況，配合 Logistic方程建立回歸方程，擬合溫度拐點(diǎn)來(lái)確定其低溫半致死溫度（LT50），具體參照解越等方法[22]。

1.3.2 隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)枝條抗寒性

采用隸屬函數(shù)法對(duì)山葡萄種質(zhì)抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。根據(jù)最適冷凍溫度下枝條 7項(xiàng)抗寒指標(biāo)（包括相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、萌枝率、凍害指數(shù)）的平均隸屬度值將山葡萄種質(zhì)抗寒性分為5個(gè)級(jí)別，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照張劍俠等的方法[5]，Ⅴ級(jí)，平均隸屬度值＞ 0.70～1.00；Ⅳ級(jí)＞ 0.60～0.70；Ⅲ級(jí)＞0.40～0.60；Ⅱ級(jí)＞ 0.30～0.40；Ⅰ級(jí) 0～0.30。

1） 生理指標(biāo)測(cè)定

相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定參照 Verslues等[23]的方法。丙二醛含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[24]；脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮比色法[25]；可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[26]；可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[27]。

2） 水培萌枝率調(diào)查

每份試材選取帶芽眼的枝段共30根，10根為1次重復(fù)，共 3次重復(fù)。經(jīng)-35 ℃最適冷凍溫度處理（處理方法同1.2）后插入水中，1個(gè)月后調(diào)查水培萌枝率，參照Nanami等[28]方法。培養(yǎng)期間每 5 d換一次水。萌枝率=萌芽枝數(shù)/總枝數(shù)×100 %。

3） 凍害指數(shù)調(diào)查

枝段經(jīng)最適冷凍溫度處理后，觀察橫切面組織在低溫處理后的褐變情況來(lái)確定凍害級(jí)別，凍害級(jí)別及冷害指數(shù)計(jì)算參照呂中偉等的方法[29]。

1.4 抗寒性的田間鑒定

通過(guò)調(diào)查每份試材的田間萌芽率來(lái)對(duì)其田間抗寒性進(jìn)行鑒定。田間萌芽率調(diào)查參照劉崇懷等[30]方法，本試驗(yàn)于2017年5月初調(diào)查每份試材在資源圃中經(jīng)自然越冬后的萌芽情況，統(tǒng)計(jì)萌芽率。萌芽率=單株芽眼萌芽數(shù)/單株總芽眼數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方程及相關(guān)性分析，利用 Duncan多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)；作圖采用 Sigmaplot10.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC染色圖像可視化評(píng)估鑒定山葡萄種質(zhì)抗寒性

山葡萄經(jīng)不同低溫處理后染色指數(shù)與冷凍溫度呈典型的倒‘S’型曲線，說(shuō)明可以利用非線性回歸分析結(jié)合Logistic方程擬合溫度拐點(diǎn)，確定低溫半致死溫度（LT50）；低溫半致死溫度越低，抗寒性越強(qiáng)[31]，‘雙優(yōu)’和‘北冰紅’低溫半致死溫度分別為-38.63和-29.75 ℃（表1），可見(jiàn) 2個(gè)品種抗寒性差異明顯；圖像可視化評(píng)估所求得的染色指數(shù)也能將‘雙優(yōu)’和‘北冰紅’的抗寒性有效分開(kāi)（圖2a）；同時(shí)不同低溫處理下枝條的水培萌芽情況與2個(gè)品種抗寒能力相符（圖2b；表2）。說(shuō)明TTC染色圖像可視化評(píng)估配合 Logistic方程鑒定山葡萄種質(zhì)抗寒性具有一定的可行性，40份山葡萄種質(zhì)抗寒性鑒定結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 40份山葡萄種質(zhì)抗寒性鑒定結(jié)果Table 1 Identification of cold resistance in 40 V. amurensis germplasms

表2 低溫處理下2個(gè)山葡萄品種枝條水培萌枝率Table 2 Shoots sprout rate of in two varieties of V. amurensis in hydroponic culture under cold temperatures %

通過(guò)對(duì)表1中同一溫度下40份山葡萄種質(zhì)的染色指數(shù)與其低溫半致死溫度的相關(guān)性分析表明，-20、-25、-30、-35和-40 ℃處理下的枝段染色指數(shù)與其低溫半致死溫度之間均呈極顯著（P＜0.000 1）負(fù)相關(guān)，其中-20 ℃下，相關(guān)系數(shù)r=-0.632 55，P＜0.000 1；-25 ℃下，r=-0.791 16，P＜0.000 1；-30 ℃下，r=-0.832 20，P＜0.000 1；-35 ℃下，r=-0.861 38，P＜0.000 1；-40 ℃下，r=-0.726 03，P＜0.000 1?？梢?jiàn)兩者在-35 ℃下的相關(guān)性最強(qiáng)，因此本研究將-35 ℃作為最適冷凍溫度，進(jìn)一步利用隸屬函數(shù)法對(duì)最適冷凍溫度下40山葡萄種質(zhì)枝條的抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

圖2 染色指數(shù)及水培萌枝率在冷凍溫度下的變化Fig.2 Change of staining index and hydroponic culture sprout rate under cold temperatures

2.2 隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)山葡萄種質(zhì)的抗寒性

枝條經(jīng)-35 ℃最適冷凍溫度處理后，對(duì)40份山葡萄種質(zhì)抗寒指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果表明，指標(biāo)變量間存在一定的相關(guān)性（表 3），說(shuō)明多個(gè)指標(biāo)提供的抗寒信息有交叉重疊現(xiàn)象，進(jìn)一步利用主成分分析對(duì)所測(cè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

表3 最適冷凍溫度下山葡萄種質(zhì)抗寒性指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of cold resistance indexes in V.amurensis germplasms under optimum freezing temperature

以累計(jì)貢獻(xiàn)率大于85%為原則選擇主成分，其中第1主成分中特征向量絕對(duì)值較大的是相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛及可溶性蛋白含量，貢獻(xiàn)率達(dá)41.48%；第2主成分則是萌枝率和凍害指數(shù)，貢獻(xiàn)率達(dá)25.70%；第3主成分中可溶性糖含量特征向量絕對(duì)值較大，貢獻(xiàn)率為15.53%；第4主成分的游離脯氨酸含量特征向量絕對(duì)值較大，貢獻(xiàn)率為10.90%。4個(gè)獨(dú)立主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為93.61%（表4），利用隸屬函數(shù)法對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，以評(píng)價(jià)山葡萄種質(zhì)的綜合抗寒性。

表4 抗寒指標(biāo)主成分分析Table 4 Principal components analysis for cold resistance indexes

依據(jù)平均隸屬度值將40份山葡萄種質(zhì)抗寒性分為5個(gè)級(jí)別，從Ⅴ級(jí)到Ⅰ級(jí)抗寒性依次降低。其中Ⅴ級(jí)抗寒種質(zhì)1份；Ⅳ級(jí)抗寒種質(zhì)10份；Ⅲ級(jí)抗寒種質(zhì)24份；Ⅱ級(jí)抗寒種質(zhì)3份；Ⅰ級(jí)抗寒2份為山歐雜種（表5）。結(jié)果表明，40份山葡萄種質(zhì)抗寒性存在明顯差異。整體來(lái)看，純種山葡萄抗寒性 ＞ 山歐雜種（對(duì)照）。

表5 隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)山葡萄種質(zhì)抗寒性Table 5 Comprehensive analysis of cold resistances in V. amurensis germplasms

2.3 田間萌芽率

本試驗(yàn)連續(xù)3 a對(duì)40份山葡萄種質(zhì)自然越冬后枝條的萌芽情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)同一資源各年份間的田間萌芽率無(wú)明顯差異。但由于田間抗寒性鑒定數(shù)據(jù)的年份要與實(shí)驗(yàn)室抗寒性鑒定數(shù)據(jù)的年份相對(duì)應(yīng)，所以本試驗(yàn)田間萌芽率為2017年的調(diào)查結(jié)果（表6）。圖3為2017年1—5月的氣象數(shù)據(jù)，最低氣溫出現(xiàn)在1月下旬，最低為-28.2 ℃。經(jīng)自然越冬后，40份山葡萄種質(zhì)因抗寒性存在差異，其田間萌芽率也表現(xiàn)出不同（表6）。

2.4 相關(guān)性分析

利用SAS相關(guān)性分析結(jié)果表明，TTC染色圖像可視化評(píng)估量化獲得的染色指數(shù)配合Logistic方程求得的40份山葡萄種質(zhì)低溫半致死溫度與其抗寒平均隸屬度、田間萌芽率均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.000 1），相關(guān)系數(shù)分別為－0.883 03（圖4a）和－0.876 70（圖4b），說(shuō)明該方法與隸屬函數(shù)法對(duì)山葡萄種質(zhì)抗寒性鑒定結(jié)果較為一致；且染色指數(shù)擬合計(jì)算出的低溫半致死溫度與實(shí)際田間萌芽率的線性關(guān)系為 y=－5.576 5x–127.36，為驗(yàn)證模型準(zhǔn)確性，另從源圃中隨機(jī)選取了15份山葡萄種質(zhì)，利用該線性關(guān)系方程計(jì)算出了 15份種質(zhì)田間萌芽率的理論值（表7），與田間萌芽率的實(shí)際值相關(guān)性為－0.985 84，說(shuō)明TTC染色圖像可視化評(píng)估配合Logistic方程求得的山葡萄種質(zhì)低溫半致死溫度能夠反映其在田間的實(shí)際抗寒性，且建模模型準(zhǔn)確。

表6 山葡萄種質(zhì)田間萌芽率調(diào)查結(jié)果Table 6 Investigation on germination rate of V. amurensis germplasms in field

圖3 2017年氣象數(shù)據(jù)Fig.3 Meteorological data in 2017

圖4 抗寒性鑒定結(jié)果的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of results in cold resistances identification

表7 抗寒性數(shù)據(jù)模型驗(yàn)證Table 7 Proof of cold resistance data model

3 結(jié) 論

1）TTC染色枝段圖像的可視化評(píng)估實(shí)現(xiàn)了染色面積的準(zhǔn)確量化，量化得出的染色指數(shù)與冷凍溫度呈典型的倒‘S’型曲線，說(shuō)明可以利用非線性回歸分析結(jié)合Logistic 方程擬合溫度拐點(diǎn)，確定低溫半致死溫度。

2）該方法量化得出的染色指數(shù)配合Logistic方程確定的40份山葡萄種質(zhì)低溫半致死溫度與其抗寒性綜合評(píng)價(jià)的平均隸屬度值及田間萌芽率值均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.000 1），相關(guān)系數(shù)分別為-0.883 03和-0.876 70。

3）染色指數(shù)擬合計(jì)算出的低溫半致死溫度與實(shí)際田間萌芽率的線性關(guān)系為y= - 5.576 5 x-127.36。利用該線性關(guān)系方程計(jì)算了建模數(shù)據(jù)以外隨機(jī)選取的山葡萄種質(zhì)田間萌芽率的理論值，與田間萌芽率的實(shí)際值相關(guān)性為-0.985 84，說(shuō)明TTC染色圖像可視化評(píng)估配合Logistic方程求得的山葡萄種質(zhì)低溫半致死溫度能夠反映其在田間的實(shí)際抗寒性。

4）40份山葡萄種質(zhì)低溫半致死溫度在-39.41～-29.75 ℃范圍內(nèi)，種質(zhì)抗寒性存在明顯差異；總體而言，該研究的純種山葡萄低溫半致死溫度的平均值為-37.25 ℃，山歐雜種山葡萄低溫半致死溫度的平均值為-29.81 ℃，可見(jiàn)純種山葡萄的抗寒性強(qiáng)于山歐雜種山葡萄。

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