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        正交試驗優(yōu)化裸花紫珠水提取工藝及外用止血作用的評估△

        2018-06-21 04:21:24張仲羅賢強周金娜周小芳黃明浩張俊清1羅喻超
        中國現代中藥 2018年6期
        關鍵詞:裸花紫珠毛蕊花

        張仲,羅賢強,周金娜,周小芳,黃明浩,張俊清1,*,羅喻超*

        (1.海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室,海南 海口 571199;2.海南醫(yī)學院藥學院,海南 海口 571199)

        裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn為馬鞭草科紫珠屬(CallicarpaLinn.)植物,又名趕風柴、節(jié)節(jié)紅、百花茶、飯湯葉、亞賽凡等[1],主要分布于我國海南,廣西,廣東等地,裸花紫珠是海南常用黎藥材[2]。主要分布于白沙,五指山瓊中等地。裸花紫珠作為藥材四季均可收獲,取裸花紫珠的地上干燥部分,陰干,去除雜質用藥,具有抗菌、消炎解毒、收斂止血、祛風除濕的功效,臨床上用于急性傳染性肝炎、化膿性炎癥、消化道出血等癥,外用常用于治燒傷、燙傷及外傷出血等?,F代研究表明,裸花紫珠主要含有黃酮、鞣質、萜類和酚類等成分[3-4],其中的苯乙醇苷類化合物毛蕊花糖苷(acteoside,AS)有顯著縮短活化部分凝血活酶時間(APTT)作用,提示裸花紫珠可能是通過影響內源性凝血途徑來發(fā)揮止血作用,其中毛蕊花糖苷在藥材中的含有量很高,可能是裸花紫珠止血的主要活性成分[5]。

        市場調查發(fā)現,目前市場上裸花紫珠制劑已有片劑、膠囊劑、合劑、分散片、栓劑和陰道片劑等劑型[6],但是缺少用于止血的外用制劑,研制裸花紫珠外用止血貼不僅可以填補市場的空缺,還能通過貼劑的特點更好發(fā)揮裸花紫珠的止血效果。本論文通過正交試驗對裸花紫珠的水提取工藝進行優(yōu)化,并進行了工藝驗證實驗。用最佳提取工藝所獲得的水提取物進行了外用止血實驗,對止血的效果進行了評估。這些都為將來裸花紫珠止血貼的研發(fā)提供了基礎。

        1 材料與儀器

        1.1 動物

        清潔級家兔,購買于廣東省醫(yī)學實驗動物中心,合格證號:SDWA-44060506-0403-20170330-00001,雌雄各半,體重2.2~2.5 kg。

        1.2 藥物及試劑

        裸花紫珠于2016年5月采自海南省白沙縣,經海南醫(yī)學院藥學院田建平教授鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn;吸水墊(7.5 cm×7.5 cm×0.1 cm)購買于優(yōu)玖責任有限公司;云南白藥創(chuàng)可貼(批號:PJE1628);甲醇、醋酸、無水乙醇均為分析純,購自廣州化學試劑廠,乙腈為色譜純,水為超純水。

        1.3 儀器

        北京賽多利斯儀器系統有限公司SO9001型電子天平;上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠GXZ-9240型數顯鼓風干燥箱;上海亞榮生化儀器廠RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器。Shimadzu LC-2010AHT高效液相色譜儀(配有紫外檢測器,自動進樣器,LC solution色譜工作站)。

        2 方法與結果

        2.1 裸花紫珠提取工藝的考察

        2.1.1 浸膏得率的測定 精密量取濾液25 mL,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,在水浴上蒸干后,于105 ℃干燥24 h,迅速轉移至干燥器中冷卻0.5 h,迅速精密稱定質量,計算浸膏得率。計算浸膏得率。

        (1)

        2.1.2 毛蕊花糖苷的測定 依照本實驗室王勇等[7]建立的色譜條件:Luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相乙腈-0.1%醋酸水溶液(15∶85),流速1.0 mL·min-1,檢測波長332 nm,柱溫30 ℃。精密稱取毛蕊花糖苷對照品25.8 mg,置25 mL量瓶中,加50%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,配成毛蕊花糖苷濃度為1.032 mg·mL-1的標準品溶液。然后分別吸取一定體積的該溶液置于25 mL量瓶中,加50%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別稀釋成6種濃度分別為0.103 2、0.206 4、0.412 8、0.516 0、0.619 2、0.825 6 mg·mL-1的對照品溶液。各濃度的溶液分別進樣2 μL,測定毛蕊花糖苷的峰面積,以毛蕊花糖苷的進樣量(μg·μL-1)為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得到毛蕊花糖苷的回歸方程為Y=3.574×106X-40 115,r=1.000 0,線性范圍為0.103 2~1.032 μg·μL-1。

        取裸花紫珠提取后的濃縮液0.5 mL,置25 mL量瓶中,加入50%甲醇稀釋至刻度。取適量,過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,測定,記錄色譜圖,計算毛蕊花糖苷(AS)提取率。

        2.1.3 藥材水提取工藝因素與水平 裸花紫珠莖葉中主要的成分毛蕊花糖苷易溶于水,因此采用水加熱回流提取方法,采用蒸餾水回流提取。由于裸花紫珠葉的吸水率較大[7],故在選擇加水量的水平時第1次加入量比后兩次大。選取考察加水量,浸泡時間,提取時間和提取次數4個因素。結合參考文獻[7-9],并進行了預實驗,最終選取了每個因素的考察水平,因素水平見表1。

        表1 裸花紫珠水提取水平因素表

        2.1.4 提取工藝正交試驗方法 取裸花紫珠地上干燥部分,將莖葉剪成均一大小,分成9份,每份約20 g,依次編號為1~9組。按照表2中L9(34)正交表規(guī)定的條件進行回流提取,提取液用200目紗布過濾,濃縮,待濃縮液冷卻后,加蒸餾水定容到100 mL,搖勻。按照2.1.1和2.1.2所述方法測定浸膏得率和毛蕊花糖苷含量。測定結果見表2及表3。

        表2 提取工藝正交試驗設計結果

        注:綜合評分=(浸膏得率/19.60×0.3+AS得率/1.77×0.7)×100。

        表3 方差分析表

        比較各因素的極差可知,因素D(提取次數)對試驗結果影響最大,其次是C、B和A,所以因素對綜合評分值指標影響大小排序為D>C>B>A。由方差分析可知,因素D具有顯著性差異。根據極差分析各因素的均值,可確定裸花紫珠藥材水提取最佳工藝為A2B3C2D3,即藥材浸泡時間2 h后,提取3次,加水量分別為12,10,10倍量,每次提取時間為1 h。

        2.1.5 工藝驗證實驗 稱取裸花紫珠藥材3份,每份50 g,按上述確定的最佳工藝條件提取,對藥材水提取工藝進行驗證,測定結果見表4。結果表明,由上述確定的最佳方案提取毛蕊花糖苷的提取率較高,該方案較為穩(wěn)定。

        表4 水提取驗證實驗結果 %

        2.2 藥效學評價

        采用最佳提取工藝提取獲得的流浸膏旋蒸濃縮,分別稀釋至浸膏濃度為1.0、0.5 g·mL-1。吸取一種濃度的流浸膏1mL均勻分布于吸水棉墊2.4 cm×1.5 cm×0.1 cm后,50 ℃減壓烘干1 h,分別制成高低兩種含藥濃度的止血棉墊,記錄各棉墊的的質量。進行預實驗[10-11],選取市售的云南白藥創(chuàng)可貼為陽性藥。結果如表5所示,顯示云南白藥創(chuàng)可貼組的平均出血時間與0.5 g·mL-1組相當,而平均出血量要低于1.0 g·mL-1組。

        表5 預實驗結果

        參考預實驗的結果,制得含藥濃度分別為0.5、1.0、2.0 g·mL-1的低中高三種止血棉墊。取成年家兔15只,隨機分為5組,低、中、高劑量組、陰性對照組和陽性對照組。將家兔左耳與右耳對齊,于耳緣末端2/3、1/2、1/3處,用一次性采血針對家兔耳緣靜脈穿刺1 cm,形成靜脈出血后立即在出血處敷以制好的止血棉墊,并用100 g砝碼壓在棉墊上,5 s觀察1次出血情況,直至出血停止。記錄出血時間,并稱量止血棉墊的質量,計算出血量。

        結果見表6和表7。

        表6 出血時間結果

        注:與空白組相比,*P<0.05,**P<0.01。

        表7 出血量結果

        注:與空白組相比,*P<0.05,**P<0.01。

        與空白組相比,裸花紫珠低、中、高劑量與云南白藥創(chuàng)可貼均可以非常顯著地減少出血量(P<0.01),其中高劑量組的出血量要低于陽性對照組;此外,高劑量組相較空白組也可以明顯地減少出血時間(P<0.01),同時高劑量的出血時間也要低于陽性對照組。綜上,說明裸花紫珠水提取物具有一定的外用止血作用,具有開發(fā)成外用止血貼劑的潛力。

        3 討論

        在正交試驗分析中,引進綜合評價的理念,使用多指標綜合加權評分法可以避免單一評價的片面性,使分析結果更加科學、客觀,使得提取工藝趨于合理、可信[12]。本研究以浸膏得率、毛蕊花糖苷的提取得率為指標,采用正交試驗設計,對裸花紫珠葉中苯乙醇苷類成分的水提取工藝進行研究,確定了最佳的提取工藝:藥材加水浸泡2 h,提取3次,加水倍量分別為12、10、10,每次提取1 h。本研究確定的提取工藝簡單可行,3次驗證實驗結果重復性較好,可為今后裸花紫珠莖葉的水提取提供參考,也為日后裸花紫珠制劑的開發(fā)提供基礎。

        本文進一步針對最佳提取工藝所獲得的裸花紫珠浸膏,進行了外用止血藥效學的研究。以出血時間和出血量為評價指標,先進行了預實驗。參考預實驗的結果,考察不同劑量對家兔耳緣靜脈出血的影響。預實驗和正式實驗的動物數量、樣本量以及實驗方法都相同,且結果基本在同一水平,兩次實驗結果都有較好的重復性。此次研究,初步證明本浸膏具有一定的外用止血作用,尤其以2.0 g·mL-1的濃度給藥時,作用效果十分顯著,甚至要優(yōu)于市售的云南白藥創(chuàng)可貼,表明了本浸膏作為外用止血藥物開發(fā)的潛力。本次研究,參考止血貼的制作流程,并采用了相應的材料,這也為裸花紫珠外用止血貼的研制提供了基礎。

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