席秀利，胡珊，鄔龍怡，鐘旺琴

(廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663)

白芍，別名芍藥，《中華人民共和國(guó)藥典》2015版載其原植物為毛茛科芍藥屬植物芍藥PaeonialactioraPall.的干燥根。其性味苦、酸，微寒。歸肝、脾經(jīng)。養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽(yáng)。用于血虛萎黃，月經(jīng)不調(diào)，自汗，盜汗，脅痛，腹痛，四肢攣痛，頭痛眩暈等癥[1]。白芍主產(chǎn)于中國(guó)安徽、四川、浙江、山東等地[2]。浙江磐安、安徽亳州、四川中江和山東菏澤作為白芍的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，在長(zhǎng)期的引種和交流中，種質(zhì)資源較為混雜，導(dǎo)致白芍種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)有較大程度的差異，品種退化嚴(yán)重，栽培種質(zhì)混雜[3]。白芍是中國(guó)傳統(tǒng)常用大宗中藥材，需求量大，且品種繁多，而種質(zhì)資源的混雜嚴(yán)重影響了白芍規(guī)范化生產(chǎn)的發(fā)展。因此有必要從源頭即白芍種質(zhì)資源、種植規(guī)范方面嚴(yán)格要求，搞清白芍藥材的地道性，建立品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從而指導(dǎo)GAP中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性分子標(biāo)記(Start codon targeted polymorphism，SCoT)是Collard和Mackill開(kāi)發(fā)的基于SPAR(單引物擴(kuò)增反應(yīng))的新的目的基因分子標(biāo)記方法。其原理是根據(jù)植物基因中ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性設(shè)計(jì)單引物，對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)的顯性多態(tài)性標(biāo)記[4]。SCoT標(biāo)記結(jié)合了ISSR標(biāo)記和RAPD標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，成本低，引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單且可以通用，多態(tài)性豐富，可用于分子輔助育種[5]。目前SCoT已被成功應(yīng)用于柑橘[6]、鐵皮石斛[7]等作物，在種屬間、品種間的遺傳多樣性分析及雜交后代的遺傳分析等研究中取得較多進(jìn)展。本研究利用SCoT分子標(biāo)記對(duì)四川中江、浙江磐安、安徽亳州、山東菏澤四大傳統(tǒng)產(chǎn)地的22個(gè)居群的白芍樣品進(jìn)行親緣關(guān)系研究和遺傳多樣性檢測(cè)。目的是從分子水平上研究22個(gè)白芍居群的親緣關(guān)系及遺傳多樣性，為白芍藥材的引種和栽培提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集來(lái)自浙江，安徽，四川，山東共22個(gè)不同居群白芍樣品，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)黃海波副教授鑒定為白芍PaeonialactioraPall.，憑證標(biāo)本保存于香雪制藥有限公司研發(fā)中心。詳細(xì)記錄樣品信息及編號(hào)，用75%乙醇清潔葉表面后保存于-80 ℃冰箱備用，具體樣品信息如下。

表1 樣品信息表

1.2 儀器和試劑

分析天平，核酸蛋白測(cè)定儀(Implen Nanophotometer)，PCR儀(BIO-RAD)，離心機(jī)(Eppendorf)，超低溫冰箱(Thermo 902-ULTS)，電泳儀、電泳槽(BIO-RAD)，制冰機(jī)，水浴鍋，凝膠成像儀(BIO-RAD)。

dNTPs、ExTaqDNA聚合酶、Mg2+、10x ExTaq Buffer、Loing Buffer(Takala)，Maker3(廣州東盛生物科技有限公司)，瓊脂糖(Biowest)，Golden View核酸染料(北京博凌科為生物科技有限公司)，TAE(50×)(生工)，植物基因組提取試劑盒(天根生化)，參考Collard和Mackill提供的36條SCoT引物序列。

2 方法

2.1 基因組DNA提取與檢測(cè)

采用天根植物基因組試劑盒提取所有材料的基因組DNA。用微量紫外核酸儀檢測(cè)DNA濃度和純度。將合格樣品DNA濃度稀釋至20 ng·μL-1后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 SCoT-PCR 反應(yīng)體系正交優(yōu)化

選用L16(54)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)，對(duì)Mg2+、dNTPs濃度、ExTaq DNA聚合酶、引物和DNA用量進(jìn)行5因素4水平的正交試驗(yàn)。以山東編號(hào)為J的DNA為模板，隨機(jī)挑選S6號(hào)引物作為擴(kuò)增引物，反應(yīng)總體積20 μL，含有10×PCR Buffer 2 μL，每個(gè)處理重復(fù)2次。

表2 PCR反應(yīng)正交體系濃度表

2.3 SCoT-PCR引物篩選

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳反應(yīng)體系對(duì)36條引物進(jìn)行篩選，設(shè)平行組。

2.4 退火溫度篩選

對(duì)篩選后的引物進(jìn)行溫度篩選，在PCR儀上設(shè)定50 ℃～60 ℃溫度區(qū)間，即50 ℃，50.9 ℃，52.3 ℃，54 ℃，56.3 ℃，58.1 ℃，59.3 ℃，60 ℃，8個(gè)溫度梯度進(jìn)行退火溫度篩選。

2.5 SCoT-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證與多態(tài)性引物篩選

選擇浙江、四川、安徽三個(gè)不同產(chǎn)地的白芍DNA為模板，按照上述優(yōu)化的SCoT-PCR體系進(jìn)行SCoT分子標(biāo)記，篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的引物。

2.6 SCoT-PCR 擴(kuò)增與檢測(cè)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入2 μL 6×loading buffer用2.0%瓊脂糖凝膠，在1XTAE電極緩沖液，120 V，30 min電泳下檢測(cè)條帶，凝膠成像儀下拍照。

2.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，對(duì)清晰且易于辨認(rèn)的條帶采用“0/1”系統(tǒng)記錄其位置，建立SCoT標(biāo)記的0/1矩陣。用NTSYS-pc2.10 e軟件計(jì)算樣品間的相似系數(shù)，并用不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 DNA提取結(jié)果

將提取的所有樣品在超微量紫外分光光度計(jì)下測(cè)量其濃度和純度，得到其A260/A280均在1.7～2.0之間，說(shuō)明DNA純度較高，符合PCR技術(shù)要求。

3.2 SCoT-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化結(jié)果分析

使用引物S6對(duì)反應(yīng)體系優(yōu)化的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，參考桂騰琴[14]直觀評(píng)價(jià)法依次對(duì)16個(gè)實(shí)驗(yàn)組結(jié)果多態(tài)性進(jìn)行評(píng)分，條帶數(shù)量豐富、清晰的計(jì)16分，涂布或無(wú)條帶的計(jì)1分，反應(yīng)1～16組體系的平均整數(shù)計(jì)分依次為：4、8、5、9、7、12、7、6、8、9、3、10、5、15、16、14分。依照計(jì)分原則，以第15組計(jì)分最高，條帶最為清晰明亮。因此考慮體系最終為1×PCR buffer，3 mmol·L-1Mg2+，0.2 mol·L-1dNTPs，0.6 μmol·L-1primer，0.75 U ExTaq酶，30ngDNA模板。

注：1～16分別為正交1～16組不同PCR反應(yīng)體系。圖1 SCoT正交體系優(yōu)化電泳圖

3.3 引物篩選及退火溫度優(yōu)化

以最佳反應(yīng)體系對(duì)36條SCoT通用引物進(jìn)行篩選，重復(fù)2次初篩選出14條引物見(jiàn)下圖2，進(jìn)行8個(gè)退火溫度梯度篩選，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度判斷條帶，采用區(qū)間溫度對(duì)篩選的引物進(jìn)行匹配最終獲得在53 ℃，56 ℃，57 ℃，59 ℃四個(gè)溫度擴(kuò)增下的13條引物。其中S29和S30號(hào)引物的退火溫度梯度篩選如下圖3。

注：1～36分別為S1～S36號(hào)引物。圖2 36條引物初篩電泳圖

注：1～8分別為50 ℃～60 ℃梯度溫度。圖3 S29和S30在8個(gè)溫度梯度下擴(kuò)增電泳圖

3.4 SCoT擴(kuò)增的多態(tài)性分析

以浙江，四川，安徽三個(gè)地域差異大的樣品對(duì)退火優(yōu)化后的13條引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，最終獲得12條擴(kuò)增帶型完整、清晰、多態(tài)性豐畗的引物(表3)。利用這12條引物對(duì)24份材料進(jìn)行SCoT擴(kuò)增，共獲得總條帶121條，其中多態(tài)性條帶共77條，多態(tài)位點(diǎn)百分率共占63.6%，多態(tài)性比率較高，在分子水平證實(shí)了白芍具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性。

注：a.安徽白芍；b.四川白芍；c.浙江白芍。圖4 部分SCoT引物多態(tài)性篩選

表3 SCOT引物擴(kuò)增結(jié)果

注：1～22為樣品表中依次排序的A1～J號(hào)樣品。圖5 S6引物對(duì)22份材料SCoT-PCR擴(kuò)增電泳圖

注：1～22為樣品表中依次排序的A1～J號(hào)樣品。圖6 S25引物對(duì)22份材料SCoT-PCR擴(kuò)增電泳圖

3.5 SCoT標(biāo)記的遺傳相似性及聚類分析

利用NTSYS軟件構(gòu)建全部材料基于SCoT數(shù)據(jù)的UPGMA樹(shù)狀圖，結(jié)果如圖7。22份材料兩兩之間的相似系數(shù)在0.78～0.94之間，以相似系數(shù)0.82為閾值可將22份材料劃分為5組，浙江的4個(gè)樣品Z1-Z4聚為一支；四川的4個(gè)樣品C3、C4、C5、C6聚為一支；安徽A1、A2與四川C1、C2聚為一支，說(shuō)明安徽與四川白芍親緣關(guān)系較近，從地理位置分析可能由于白芍地方引種和雜交導(dǎo)致，因此安徽白芍與四川白芍差異不大；山東B、C、J三個(gè)樣品聚為一支，且與四川和安徽白芍親緣關(guān)系較近，可能因山東白芍多來(lái)源于栽培，而栽培品種來(lái)源混雜，從聚類樹(shù)上可以初步認(rèn)為部分山東白芍由四川或者安徽引種得來(lái)；剩下7個(gè)的山東樣品則聚為一組。

圖7 22個(gè)不同產(chǎn)地白芍樣品的聚類分析圖

4 討論

近年來(lái)，采用分子生物技術(shù)對(duì)藥材鑒別已成為趨勢(shì)，目前白芍及品種的分子鑒定僅出現(xiàn)AFLP[9]、RAPD[10-11]、ISSR[12-13]、DNA條形碼[14]的研究，然而尚未有關(guān)SCoT標(biāo)記在白芍親緣關(guān)系鑒定中應(yīng)用的研究報(bào)道。其中周佐斌[11]使用ISSR分析對(duì)白芍種質(zhì)資源的遺傳多態(tài)性性分析，主要對(duì)浙江磐安白芍為主要研究對(duì)象，并以花色特征的種內(nèi)變異為研究?jī)?nèi)容，發(fā)現(xiàn)浙江磐安白芍與外省居群分支明顯。徐攀[13]等人采用DNA條形碼技術(shù)和隨機(jī)多態(tài)性RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)12個(gè)不同品種的白芍種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)DNA條形碼分子標(biāo)記在種內(nèi)水平中并不能很好的區(qū)分相關(guān)的品種和品系，而RAPD分子標(biāo)記的結(jié)果也證明了現(xiàn)有的白芍種質(zhì)資源中存在較為豐富的遺傳多樣性。

SCoT標(biāo)記作為一種新型的目的基因分子標(biāo)記，結(jié)合了ISSR和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、引物通用性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)成本較低。本實(shí)驗(yàn)從36條SCoT通用引物中最終篩選出12條清晰、條帶豐富的作為不同產(chǎn)地白芍的SCoT分子標(biāo)記的引物，驗(yàn)證了其穩(wěn)定性及可靠性。引物擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)百分率占63.6%，在分子水平證實(shí)了不同產(chǎn)地白芍具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性，本研究通過(guò)NTSYS軟件進(jìn)行相似系數(shù)和UPGMA聚類分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同產(chǎn)地白芍22份樣品的初步區(qū)分。不同地區(qū)白芍樣品在聚類樹(shù)上基本聚為一類，浙江、安徽白芍在聚類圖上的聚類相對(duì)明顯，且同產(chǎn)地內(nèi)的白芍相似系數(shù)高。而安徽白芍與四川部分白芍則出現(xiàn)混種現(xiàn)象，同時(shí)部分山東白芍樣品與安徽，四川兩地部分樣品親緣關(guān)系近，這可能由于白芍經(jīng)過(guò)短期引種和馴化導(dǎo)致品種間混雜現(xiàn)象。這對(duì)比研究結(jié)果表明SCoT技術(shù)能從分子水平上檢測(cè)不同產(chǎn)地和居群之間白芍的基因差異，可以從基因水平把不同地區(qū)植株外型相似的白芍品種區(qū)分開(kāi)，對(duì)新品種的選育有很大的意義。

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