張志國，孫亞范，田玉新，張澤高，何清毅

（1.唐山三元食品有限公司，河北唐山301501；2.天津市乳品食品監(jiān)測中心，天津300381）

低聚半乳糖在人體內(nèi)不能被消化吸收，直接進入大腸被腸道雙歧桿菌利用，促進雙歧桿菌增殖，因此被定義為益生元。低聚半乳糖能有效促進人體腸道內(nèi)的雙歧桿菌增殖，促進鈣、鐵吸收，有助于腸道健康，通過雙歧桿菌增殖合成B族維生素提供營養(yǎng)，改善脂質(zhì)代謝，提高人體免疫力等多種生理功能[1-2]。

作為功能性低聚糖，我國允許食品企業(yè)將低聚半乳糖添加在嬰幼兒食品中[3]。目前大多數(shù)嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)企業(yè)都在自己的嬰幼兒配方奶粉中添加了不同含量的低聚半乳糖，作為產(chǎn)品宣傳點[4-6]。

在實際生產(chǎn)過程中由于低聚半乳糖成分復雜，沒有合適的檢驗方法標準和對照品進行定量檢測，給企業(yè)進行研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)量管理帶來困難。利用離子色譜法構(gòu)建低聚半乳糖指紋圖譜的高分離效率和高靈敏度的優(yōu)點[7]，通過分析低聚半乳糖指紋圖譜的特征，參考中藥領域中指紋圖譜技術(shù)的研究與應用[8-10]，選擇特征組分完成嬰幼兒配方奶粉中低聚半乳糖含量的測定，為嬰幼兒配方奶粉的質(zhì)量控制提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

低聚半乳糖：唐山三元食品有限公司；β-半乳糖苷酶（12 U/mg，500 kU/瓶）、乙酸鈉（99%）、氫氧化鈉（50%，1.515 g/mL）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙腈（色譜純）：天津市天昊化工有限公司；磷酸二氫鉀（色譜純）、三水磷酸氫二鉀（色譜純）、十二水磷酸氫二鈉（色譜純）、氫氧化鈉（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高效離子色譜儀（ICS-5000，配脈沖安培檢測器PAD）、CarboPacPA200保護柱（3 mm×50 mm）、CarboPac PA200分析柱（3 mm×250 mm）：美國賽默飛公司；反相固相萃取柱（填料為苯乙烯二乙烯基苯，2.5 mL）、微孔濾膜（水相，0.22 μm）：天津博納艾杰爾科技有限公司；Millipore超純水處理裝置：密理博中國有限公司；恒溫水浴搖床（控溫精度±1℃）、離心機（轉(zhuǎn)速≥3 000 r/min）、精密 pH 儀（PHS-3C）：上海精密儀器儀表有限公司；分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑配制

1）磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.0）：22.0 g 磷酸二氫鉀和6.0 g三水磷酸氫二鉀溶于水中，稀釋至1 L。120℃高壓滅菌器中滅菌30 min。

2）鹽酸溶液（1 mol/L）：量取 83.0 mL濃鹽酸溶于超純水中，稀釋至1 L。

3）氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：稱取40.0 g氫氧化鈉，用100 mL無二氧化碳超純水溶解，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用無二氧化碳超純水定容至刻度，儲存在具膠塞試劑瓶中。

4）β-半乳糖苷酶溶液（2 000 U/mL）：稱取活性約為12 U/mg的來源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的半乳糖苷酶16.67g，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液制成100 mL、半乳糖苷酶最終活性為2 000 U/mL的溶液。在pH 4.5和25℃條件下，1個單位可將1.0 mol o-硝基苯基-D-半乳糖苷水解為o-硝基苯酚和D-半乳糖?；鞈乙翰挥脮r儲存于冰箱中。使用前充分振搖混懸液。酶混懸液制備后8 h內(nèi)使用。

5）乙腈溶液（20%）：量取200 mL乙腈，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

6）乙腈溶液（3%）：量取30 mL乙腈，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

7）氫氧化鈉溶液（250 mmol/L/L）：量取 50%氫氧化鈉溶液13.2 mL，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度，通入氮氣保護室溫下可放置7 d。

8）乙酸鈉溶液（100 mmol/L/L）：精密稱取乙酸鈉8.2 g，用無二氧化碳超純水100 mL溶解轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度，通入氮氣保護室溫下可放置7 d。

9）氫氧化鈉（100 mmol/L）、乙酸鈉（1 mol/L）混合溶液：稱取4.0 g氫氧化鈉和82.0 g乙酸鈉（精確至0.001 g），用水稀釋至1 L，通入氮氣保護室溫下可放置7 d。

10）低聚半乳糖對照品貯備溶液（1 500 mg/L）：精確稱取約0.331 g（精確至0.1 mg，換算成低聚半乳糖含量為1 500 mg）低聚半乳糖糖漿于50 mL燒杯中，加入約10 mL水，待糖漿溶解后，用水稀釋至100 mL容量瓶中，搖勻。

11）低聚半乳糖對照品工作溶液：取適量低聚半乳糖對照品貯備液，用水配制稱質(zhì)量濃度為15、30、60、90 mg/L的標準曲線工作溶液。

1.3.2 樣品處理

精密稱取奶粉樣品1.000 0 g（精確至0.000 1 g，含低聚半乳糖 500 mg/100 g～4 000 mg/100 g），置于 100 mL容量瓶中，加水40 mL，振搖使其溶解，60℃水浴10 min。放至室溫后，加乙腈至刻度，搖勻。靜置10 min，取上清液進行離心，1 000 r/min離心10 min。取離心上清液1.0 mL，加水稀釋至10 mL，搖勻，取溶液過0.22 μm濾膜，取過濾膜的濾液5.0 mL過反相固相萃取柱，濾液備用。

1.3.3 離子色譜條件

1）色譜柱：CarboPac PA20分析柱（3 mm×250 mm），保護柱CarboPac PA20保護柱（3 mm×50 mm）；

2）色譜柱溫度：30℃；

3）流動相：A：氫氧化鈉溶液（250 mmol/L）；B：乙酸鈉溶液（100 mmol/L）；C：氫氧化鈉溶液（100 mmol/L）乙酸鈉溶液（1 mol/L）混合溶液；D：水。梯度洗脫條件見表1。

4）PAD 靈敏度：3 μC；

5）進樣量：10 μL；

6）檢測池溫度：30℃；

7）在正式進樣檢測前，按照梯度洗脫模式運行，當基線穩(wěn)定后即可進樣。

采用CarboPac PA20分析柱分析低聚半乳糖的流動相梯度見表1。

表1 采用CarboPac PA20分析柱分析低聚半乳糖的流動相梯度Table 1 Eluent gradient of galactooligosaccharides analyzed by CarboPac PA20 analytical column with IC

1.3.4 樣品處理

1）低聚半乳糖定性分析

根據(jù)低聚半乳糖原料的指紋圖譜識別出3個～5個低聚半乳糖的特征組分色譜峰，與奶粉樣品中的低聚半乳糖的特征組分色譜峰作比較，確定樣品中低聚半乳糖組分。

2）樣品中低聚半乳糖含量計算公式

式中：X為試樣中低聚半乳糖的含量，mg/100 g；C為從標準曲線上計算出的樣品的濃度，mg/L；V為試樣的稀釋體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 指紋圖譜法測定奶粉中低聚半乳糖含量的原理

目前，低聚半乳糖的檢測方法標準只有AOAC 45.4.12-2001.02《Determination of trans-Galactooligosaccharides（TGOS）in Selected Food Products》標準，我們國家還沒有發(fā)布低聚半乳糖檢測方法的國家或行業(yè)標準。而且AOAC 45.4.12-2001.02標準不適用于乳糖含量高的奶粉樣品[11]。

而且，低聚半乳糖生產(chǎn)工藝的差別對低聚半乳糖組分和比例的影響很大，形成不同公司低聚半乳糖組分的復雜性，因此使用外標方法檢測存在難度?？紤]到同一公司在生產(chǎn)工藝上的一致性，利用同一批次的低聚半乳糖原料作為已知含量的標準樣品，通過選擇原料中低聚半乳糖指紋圖譜中的特征組分[7]，利用特征組分測定奶粉樣品中的低聚半乳糖含量。對照品中低聚半乳糖含量依據(jù)AOAC 45.4.12-2001.02標準[12]和HPLC雙柱法測定低聚半乳糖平均聚合度[13]兩個方法進行測定，得到對照品中低聚半乳糖的含量。

2.2 低聚半乳糖指紋圖譜特征組分的選擇

按照1.3.3的離子色譜條件構(gòu)建低聚半乳糖的指紋圖譜，再按照AOAC 45.4.12-2001.02標準[12]中低聚半乳糖測定方法中的水解步驟，確定對照品中各個低聚半乳糖的組分，將確定的低聚半乳糖組分按照保留時間先后的順序編號（將分離完全的低聚半乳糖組分單獨編號，將低聚半乳糖組分不能夠完全分離但是與干擾物質(zhì)完全分離的重疊低聚半乳糖組分按照一個組分編號），再按照編號組分的色譜響應值從高到低的順序編號，選擇與干擾物質(zhì)分離效果較好、色譜響應值較高的3個～5個低聚半乳糖組分作為特征組分，用作嬰幼兒配方奶粉中低聚半乳糖含量的測定[7，14]。產(chǎn)品測定使用對應原料作為對照品進行低聚半乳糖組分定性和外標法定量（用特征組分的色譜峰面積表示測得的對照品中低聚半乳糖含量）。低聚半乳糖對照品的色譜圖分析見圖1，嬰兒配方奶粉中低聚半乳糖的色譜圖分析見圖2。

2.3 檢出限和線性范圍

利用已知低聚半乳糖含量的對照品進行測試，當稱樣量為1.0 g時，檢出限為2.5 g/kg，定量限為5.0 g/kg，線性范圍為 4.0 g/kg～64.5 g/kg。

圖1 低聚半乳糖對照品的分離結(jié)果Fig.1 Isolation of standard galactooligosaccharides

圖2 嬰兒配方奶粉中低聚半乳糖的分離結(jié)果Fig.2 Isolation of galactooligosaccharides in milk powder

2.4 回收率試驗

稱取同一個嬰兒配方奶粉18個，分3個水平加入已知含量的低聚半乳糖糖漿溶液，每個加標水平平行測定6次，進行方法的回收率和精密度的測定。按照1.3.1中的按照1.3.2中的樣品處理方法制備樣品溶液，按照1.3.3中的離子色譜條件進行分析，計算回收率和精密度結(jié)果，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，3個水平的加標回收率在94.0%～106.7%之間，相對標準偏差為1.2%～2.8%，結(jié)果表明指紋圖譜法測定低聚半乳糖方法的準確度和精密度滿足嬰幼兒配方奶粉中低聚半乳糖含量測定的需要。

2.5 重復性試驗

利用添加了低聚半乳糖的嬰幼兒配方奶粉進行重復性試驗，準確稱取7份添加了低聚半乳糖的嬰幼兒配方奶粉（同一個樣品）各0.5 g，按照1.3.1中的按照1.3.2中的樣品處理方法制備樣品溶液，按照1.3.3中的離子色譜條件進行分析，計算重復測定結(jié)果，結(jié)果見表3。

從表3中可以看出，分別對3個嬰幼兒配方奶粉樣品進行的7次重復測定結(jié)果，RSD值分別為2.50%、1.78%、2.44%，結(jié)果表明指紋圖譜法測定嬰幼兒配方奶粉中低聚半乳糖方法重現(xiàn)性良好。

表2 方法的回收率及相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method

表3 方法的精密度試驗Table 3 The tests for precision of the method

3 結(jié)論

IC指紋圖譜測定嬰幼兒配方奶粉中低聚半乳糖含量，樣品前處理簡單、快速，不用購買復雜的標準樣品，方法的重復性、準確度、精密度滿足嬰幼兒配方奶粉中低聚半乳糖含量測定的需要，解決了不同企業(yè)生產(chǎn)的低聚半乳糖組分復雜不易檢測的技術(shù)難點，實現(xiàn)了嬰幼兒配方奶粉中低聚半乳糖含量的測定。

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