黃鸞玉，韋信賢，童桂香，楊姝麗，吳祥慶，蒙源，吳明媛

（廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧530021）

甲基睪酮（methyltestosterone，MET）是一種人工合成的類固醇類雄性激素，又稱甲基睪丸素和甲睪酮。由于MET藥效顯著且穩(wěn)定，容易獲得，在漁業(yè)生產(chǎn)中已有50年使用史，育苗期間的使用尤為普遍。MET具有增強(qiáng)雄性體征和蛋白質(zhì)同化的雙重作用，能提高飼料轉(zhuǎn)化率并促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[1]，育苗期間常通過(guò)藥餌投喂、浸浴幼魚等給藥方式來(lái)促進(jìn)苗種性別轉(zhuǎn)變，提高個(gè)體增長(zhǎng)速率，最終大幅度提高水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。MET在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢，蓄積性強(qiáng)，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，比如擾亂激素平衡、影響生育能力，致胎體中毒、致肝中毒和致癌等[2-4]，導(dǎo)致國(guó)人對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全的信心下降，出口貿(mào)易頻遭綠色壁壘。因此，檢測(cè)水產(chǎn)品中MET殘留量尤為迫切。

目前水產(chǎn)品中MET的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[5-8]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]、酶聯(lián)免疫法[12]、化學(xué)發(fā)光法[13]、毛細(xì)管電泳法[14]等。酶聯(lián)免疫法的缺點(diǎn)是易出現(xiàn)假陽(yáng)性，只能用作初步篩查。液相色譜-質(zhì)譜法儀器昂貴，不利于在各級(jí)檢測(cè)機(jī)構(gòu)全面開展檢測(cè)工作。氣相色譜-質(zhì)譜法需要對(duì)分析物進(jìn)行衍生化，結(jié)果不穩(wěn)定。相對(duì)而言，高效液相色譜法更能滿足日常檢測(cè)需求。中國(guó)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)正是采用液液萃取-高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品MET殘留物[8]。在日常檢測(cè)工作中，發(fā)現(xiàn)該方法凈化效果不好，儀器分析時(shí)間長(zhǎng)，加標(biāo)回收率偏低，不適合批量檢測(cè)，很有必要進(jìn)行優(yōu)化。本研究以中國(guó)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3029-2006《水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康臏y(cè)定》為基礎(chǔ)，對(duì)液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中MET含量的兩種前處理方法及色譜條件的線性、精密度、回收率、穩(wěn)定性、適用性等方面進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，目的是尋找最合適檢測(cè)水產(chǎn)品中MET殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

超高壓液相色譜儀（ACQUITY UPLC）：美國(guó)Waters公司；高效液相色譜儀（Agilent1200）、固相萃取裝置：德國(guó) Agilent公司；平行蒸發(fā)儀（Syncore Polyvap）：瑞士buchi公司；循環(huán)水冷卻器（H35）：萊伯泰科有限公司；多管架自動(dòng)平衡離心（TDZ5-WS）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；往復(fù)式振蕩器（ZWF-334）：上海智城分析儀器制造有限公司；離心機(jī)（TD6M）：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；固相萃取柱（poly-sery HLB，60 mg，3 mL）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.1.2 試劑

MET標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度98%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（色譜純）：美國(guó)Tedia公司；無(wú)水乙醚（分析純）：西隴化工有限公司；石油醚（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；甲酸、異丙醇（色譜純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；酸化乙腈：乙腈-甲酸（199/1，體積比）。

檢測(cè)樣品按照《水產(chǎn)品抽樣方法》[15]的規(guī)定處理。

1.2 MET檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取MET標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.2 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-18℃存放。使用前用甲醇稀釋成5 μg/mL工作液，再分別移取適量工作液，用80%甲醇水溶液配成濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.500 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2 樣品制備

將供試樣品置于常溫條件自然解凍，取適量樣品制成細(xì)小、均勻的魚糜樣。

1.2.3 樣品提取與凈化

方法1：參照中國(guó)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3029-2006《水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康臏y(cè)定》，稍有改進(jìn)。具體方法：稱取（5.00±0.05）g樣品置于 50 mL離心管中，加入15 mL無(wú)水乙醚，振蕩提取10 min，4 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至平行蒸發(fā)管中，再向離心管中加入10 mL無(wú)水乙醚，重復(fù)提取1次，上清液合并至蒸發(fā)管中，經(jīng)40℃平行蒸發(fā)至干。用3 mL 80%的甲醇水溶液溶解殘?jiān)?，加? mL石油醚，旋渦混勻去脂，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min。棄去石油醚層，取下層溶液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜儀測(cè)定。

方法 2：稱取（5.00±0.05）g樣品置于 50 mL離心管中，加入15mL酸化乙腈，勻漿30s，振蕩提取10min，4 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至平行蒸發(fā)管中，再向離心管中加入8 mL酸化乙腈，重復(fù)提取1次，上清液合并至蒸發(fā)管中。向蒸發(fā)管中加入10 mL異丙醇，經(jīng)55℃平行蒸發(fā)至干。用3 mL甲醇溶解殘?jiān)?，加? mL純凈水，混勻，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，放置冰箱冷凍30 min，6 000 r/min離心10 min。取甲醇溶液層通過(guò)預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL水活化的HLB柱上樣，以小于2 mL/min的流速過(guò)柱，棄去濾液，用6 mL水淋洗，待淋洗液全部流出后抽HLB柱近干，棄去流出液，用4 mL 80%的甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液，定容至4 mL，混勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供超高壓液相色譜儀測(cè)定。

1.2.4 色譜條件

1.2.4.1 高效液相色譜法

色譜柱：Luna 5u C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（78/22，體積比）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

1.2.4.2 超高壓液相色譜法

色譜柱：BEH C18 柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（70/30，體積比）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

1.2.5 計(jì)算公式

以保留時(shí)間定性，峰面積定量，根據(jù)下式計(jì)算水產(chǎn)品MET的殘留量。

式中：C 為樣品中 MET 的含量，（μg/kg）；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得提取液中MET的含量，（μg/mL）；v為提取液定容體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為稱樣量，kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)的采集

2.1.1 高效液相色譜法

在高效液相色譜法的儀器條件下，用進(jìn)樣器進(jìn)20 μL濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別進(jìn)20 μL經(jīng)過(guò)方法1前處理后的空白樣品和加標(biāo)濃度為100 μg/kg的加標(biāo)樣品，根據(jù)其出峰時(shí)間定性，考察MET信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度、溶劑雜質(zhì)響應(yīng)強(qiáng)度和樣品分離效果。結(jié)果見圖1。

由圖1可知，MET出峰時(shí)間為7.1 min～7.5 min。用無(wú)水乙醚作為提取劑，溶劑峰明顯高于目標(biāo)峰。樣品圖譜復(fù)雜，目標(biāo)峰附近雜峰多，容易干擾目標(biāo)峰定性與定量分析。有研究表明，用石油醚、正己烷除脂時(shí)，兩種試劑均會(huì)對(duì)目標(biāo)峰組分造成一定干擾[16]。因此，需要對(duì)方法1的提取劑及除脂方式進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 高效液相色譜法圖譜Fig.1 Chromatograms of high performance liquid chromatography

2.1.2 超高壓液相色譜法

MET結(jié)構(gòu)式中有極性的羥基、羧基和非極性的碳環(huán)[17]，易溶于乙腈，同時(shí)因?yàn)榇嬖诹u基，采用酸性條件更利于提取，因此，方法2選擇酸化乙腈來(lái)沉淀部分樣品蛋白質(zhì)，提取MET。在超高壓液相色譜法的儀器條件下，用進(jìn)樣器分別進(jìn)5 μL濃度為0.1 μg/mL的MET標(biāo)準(zhǔn)溶液、經(jīng)方法2前處理的空白樣品和100 μg/kg加標(biāo)樣品提取液，色譜圖見圖2。

圖2顯示，MET出峰時(shí)間為3.8 min～4.2 min。用酸化乙腈作為提取劑，溶劑峰明顯降低。樣品經(jīng)冷凍離心脫脂，再經(jīng)HLB柱凈化，目標(biāo)峰附近沒(méi)有雜峰，定性和定量分析均不受雜峰干擾。

圖2 超高壓液相色譜法圖譜Fig.2 Chromatograms of ultra-high pressure liquid chromatography

2.2 線性關(guān)系

將1.2.1所配的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用1.2.4的兩種色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。高效液相色譜法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=11.5723X-0.132 3，r=0.999 1，在 0.050 μg/mL～1.000 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；超高壓液相色譜法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=70163.9X-117.2，r=0.9996，在 0.025 μg/mL～2.500 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。相關(guān)系數(shù)表明，超高壓液相色譜法有相對(duì)較寬的線性范圍。

2.3 檢出限

本試驗(yàn)以3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算方法檢出限，得到方法1的檢出限為10 μg/kg，方法2的檢出限為5 μg/kg。方法2降低了溶劑峰和基質(zhì)干擾，檢出限明顯降低。

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一濃度的MET標(biāo)準(zhǔn)品，分別用兩種色譜條件平行測(cè)定5次，分別計(jì)算MET含量，考察精密度，結(jié)果列于表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 1 The precision experimental results（n=5）

兩種檢測(cè)方法的RSD均小于10%，均能滿足檢測(cè)需求。

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

為考察兩種方法的準(zhǔn)確度，以未檢出MET的羅非魚肌肉作為空白樣品，設(shè)計(jì)10、50、100 μg/kg的加標(biāo)濃度，測(cè)定MET的回收率，每種方法每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定5次，結(jié)果見表2。

表2 不同方法MET回收率（n=5）Table 2 Rate of recovery in different methods（n=5）

由表2可知，方法1的回收率在70.0%～80.4%之間，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.2%～9.1%之間；方法2的回收率在81.2%～91.1%之間，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.3%～5.5%之間。在相同加標(biāo)濃度下，方法2的平均回收率和精密度高于方法1。方法2的3個(gè)加標(biāo)濃度的平均回收率均大于80%；方法1在其10倍檢出限濃度水平（100 μg/kg）下，才獲得80.4%的平均回收率，回收率偏低。

2.6 樣品檢測(cè)對(duì)比

取50個(gè)不同的水產(chǎn)品樣品，按照1.2.3的處理過(guò)程，同時(shí)采取兩種方法檢測(cè)，方法2前處理因要使用HLB柱凈化，需要0.7 h，冷凍脫脂需要0.5 h，比方法1前處理的時(shí)間長(zhǎng)。方法2檢測(cè)出峰時(shí)間為4 min左右，儀器測(cè)試一個(gè)樣品需要7 min，而方法1儀器測(cè)試一個(gè)樣品需要15 min。儀器測(cè)試50個(gè)樣品方法2比方法1節(jié)約了約6.7 h。從整體檢測(cè)時(shí)間來(lái)分析，方法2更快捷。從檢測(cè)準(zhǔn)確性來(lái)比較，方法2結(jié)果更穩(wěn)定準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)比研究，兩種方法線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0，線性關(guān)系均良好，方法2檢測(cè)信號(hào)干擾較少，檢出限達(dá)到5 μg/kg，比方法1低1倍。方法2的回收率和精密度比方法1高，結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確。方法2儀器分析流速為0.2 mL/min，比方法1節(jié)約流動(dòng)相0.8 mL/min；方法2儀器分析時(shí)間較短，每進(jìn)一個(gè)樣可以節(jié)約8 min。大批量進(jìn)樣的時(shí)候，方法2可以節(jié)約數(shù)量可觀的流動(dòng)相和分析時(shí)間，實(shí)用性強(qiáng)，更適合快速測(cè)定水產(chǎn)品中MET殘留物的含量。

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