王紀(jì)輝，田婭玲，侯娜，*，耿陽陽，胡伯凱，梁美，何佳麗

（1.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院貴州省核桃研究所，貴州貴陽550005；2.黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州黔東南苗族侗族自治州556000）

核桃（Juglans regia），又稱胡桃、羌桃，為胡桃科植物。核桃富含脂肪、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，即可生食，又可作為食品輔料進(jìn)行添加[1]，目前核桃已經(jīng)成為高效優(yōu)質(zhì)補(bǔ)品之一。核桃蛋白為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，每100 g核桃含有蛋白質(zhì)16.67 g[2]，核桃蛋白中氨基酸種類齊全，含有8種必需氨基酸[1]，氨基酸中以精氨酸、谷氨酸含量最高[3-4]，在開發(fā)植物蛋白方面具有很大的市場前景。有關(guān)研究表明：冷榨后的核桃餅粕中蛋白質(zhì)含量高達(dá)33.2%[5]，而目前我國的核桃餅粕大都用于飼養(yǎng)牲畜[6]，對核桃餅粕中富含的蛋白質(zhì)資源造成極其不合理的利用與浪費(fèi)[7]。有關(guān)科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，核桃多肽的生理活性較高，具有抑制炎癥，清除體內(nèi)自由基，延緩衰老等功能[8-9]，大力開發(fā)集天然、安全、高效于一身的核桃多肽抗氧化劑具有很廣闊的市場潛力[10-11]。然而，目前對于水解核桃餅粕制備核桃多肽的研究大都集中于單一酶類，針對復(fù)合酶水解制備核桃多肽的研究則較少[12-14]，如果以不同酶類進(jìn)行復(fù)合，充分利用其協(xié)同增效作用，對于提高核桃餅粕的水解程度具有重要的意義[15]。

因此，本研究以冷榨后的核桃餅粕為原料，水解度為考察指標(biāo)，以雙酶復(fù)配同步水解核桃餅粕為基礎(chǔ)[16]，通過單因素和正交試驗對雙酶復(fù)配酶解核桃餅粕制備核桃多肽進(jìn)行優(yōu)化，研究結(jié)果對充分利用核桃副產(chǎn)物，提高核桃附加產(chǎn)值，助力貴州省實現(xiàn)脫貧攻堅具有重要的現(xiàn)實意義[17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃冷榨餅粕：（實驗室自制）；正己烷（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；木瓜蛋白酶（72×104U/g）、中性蛋白酶（14×104U/g）、堿性蛋白酶（9.3×104U/g）、胰蛋白酶（11×104U/g）、鄰二氮菲、氫氧化鈉（分析純）：四川化工有限公司；DPPH（分析純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

50T型液壓榨油機(jī)：河南貝斯德糧油機(jī)械工程公司；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱：鶴壁市天冠儀器儀表有限公司；L5S型紫外可見分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；FD1A-50型冷凍干燥機(jī)：江陰市新申寶科技有限公司；FW-100型高速萬能粉碎機(jī)：北京成萌偉業(yè)科技有限公司；TDL-40B型離心機(jī)：常州市儀都儀器有限公司；DEITA320型酸度計：上海平軒科學(xué)儀器有限公司；85-2A型恒溫磁力攪拌器：常州金壇良友儀器有限公司；HH-54型恒溫水浴鍋：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 核桃多肽制備

1.3.2 蛋白質(zhì)水解度的測定

總氮的測定采用凱氏定氮法GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)食品中蛋白質(zhì)的測定》，氨態(tài)氮的測定采用雙指示劑甲醛滴定法[18]。核桃餅粕中蛋白質(zhì)水解度計算公式如下：

1.3.3 單因素試驗

選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶作為水解酶類，在復(fù)合酶質(zhì)量配比為（1∶1、1∶2、1∶3、2 ∶1、3 ∶1）、底物質(zhì)量濃度為（10、20、30、40、50g/L），酶添加量為（1%、3%、5%、7%、9%），溫度為（30、35、40、45、50、55、60 ℃），pH 值為（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），酶解時間為（2、3、4、5、6 h），測定核桃餅粕中蛋白質(zhì)的水解度，考察酶種類、復(fù)合酶配比、底物質(zhì)量濃度、酶添加量、溫度、pH值、時間對核桃餅粕中蛋白質(zhì)水解效果的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素研究的基礎(chǔ)上，依據(jù)單因素研究結(jié)果，選擇溫度、pH值、底物質(zhì)量濃度、時間、酶添加量為研究因素，以水解度為指標(biāo)，研究影響雙酶復(fù)合水解核桃餅粕制備核桃肽的因素。正交試驗設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 統(tǒng)計分析

研究數(shù)據(jù)（3次數(shù)據(jù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）采用Excel2007制圖及SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶種類的選擇

按復(fù)合酶質(zhì)量配比為1∶2（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶2）、溫度35℃、pH 值 6.0、底物質(zhì)量濃度 30 g/L、時間3 h、酶添加量3%，研究酶種類對水解度的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，4種蛋白酶均可以酶解核桃餅粕制備核桃多肽，然而4種酶的水解能力卻有所不同，4種酶的水解能力大小順序為中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰蛋白酶，其中中性蛋白酶與木瓜蛋白酶之間差異性顯著（p＜0.05），并且這2種酶與堿性和胰蛋白酶之間均呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），但堿性蛋白酶與胰蛋白酶之間無顯著性差異。4種蛋白酶均在其最適條件水解相同時間后，中性蛋白酶水解度最高（8.47%），效果最佳，胰蛋白酶水解程度最差（5.94%）。因此，后續(xù)研究選擇中性蛋白酶和木瓜蛋白酶作為水解酶類。

圖1 酶種類對水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme species on degree of hydrolysis

2.1.2 復(fù)合酶質(zhì)量配比對水解度的影響

以中性蛋白酶和木瓜蛋白酶為水解酶，按溫度35℃、pH值6.0、底物質(zhì)量濃度30 g/L、時間3 h、酶添加量3%，研究復(fù)合酶質(zhì)量配比對水解度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 復(fù)合酶質(zhì)量配比對水解度的影響Fig.2 Effect of compound enzyme mass ratio on degree of hydrolysis

由圖2可知，復(fù)合酶質(zhì)量配比為2∶1時（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶），核桃蛋白水解程度最大，并且與其它復(fù)合酶質(zhì)量比均呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），復(fù)合酶質(zhì)量配比為3∶1的水解度次之，但與復(fù)合酶質(zhì)量配比為 1∶1、1∶2、1∶3也存在差異性（p＜0.05），而復(fù)合酶質(zhì)量配比1∶2、1∶3之間差異性不顯著，但與復(fù)合酶質(zhì)量配比為1∶1卻呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05）。由于復(fù)合酶之間的協(xié)同增效作用，復(fù)合酶的水解程度高于單一用酶，綜上，后續(xù)研究選擇復(fù)合酶質(zhì)量配比為2∶1。

2.1.3 溫度對水解度的影響

以復(fù)合酶質(zhì)量配比為2∶1，按pH值6.0、底物質(zhì)量濃度30 g/L、時間3 h、酶添加量3%，研究溫度對水解度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

由圖3可知，核桃蛋白水解度隨溫度的升高呈現(xiàn)先升高而后逐漸降低的趨勢，在溫度為40℃時，蛋白水解度達(dá)到最大，并且與其它溫度梯度之間均呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），酶解溫度為45℃時的水解度與其余溫度梯度之間也出現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），核桃蛋白水解度僅次于40℃，此后核桃蛋白水解度下降趨勢加快，究其主要原因是水解能力強(qiáng)的中性蛋白酶活力逐漸降低直至失活，依上述分析得出后續(xù)研究選擇溫度為40℃。

2.1.4 pH值對水解度的影響

以復(fù)合酶質(zhì)量配比為2∶1、溫度為40℃，按底物質(zhì)量濃度30 g/L、時間3 h、酶添加量3%，研究pH值對水解度的影響，結(jié)果見圖4。

pH值是酶活性的關(guān)鍵參數(shù)之一。酶作為特殊蛋白質(zhì)，它的分子構(gòu)像以及其所處的解離狀態(tài)、底物分子的解離狀態(tài)都會依據(jù)pH值的不同而發(fā)生變化[19]，進(jìn)而影響酶和底物結(jié)合、催化。所以只有處于適宜的pH環(huán)境條件下，酶和要催化的底物才能處于最易于結(jié)合的狀態(tài)，才能有效的對底物進(jìn)行徹底催化[20]。

從圖4可以看出，pH值對核桃蛋白水解程度有顯著影響，在pH值為7.0時，核桃蛋白的水解程度處于最佳點(diǎn)，并且不同pH值之間的水解度兩兩之間存在顯著性差異（p＜0.05），之后隨著pH值偏于堿性，核桃蛋白水解程度明顯下降，綜上選擇pH值為7.0作為后續(xù)研究所需。

2.1.5 酶添加量對水解度的影響

以復(fù)合酶質(zhì)量配比為2∶1、溫度為40℃、pH值為7.0，按底物質(zhì)量濃度30 g/L、時間3 h，研究酶添加量對水解度的影響，結(jié)果見圖5。

圖4 pH值對水解度的影響Fig.4 Effect of pH on the degree of hydrolysis

圖5 酶添加量對水解度的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on the degree of hydrolysis

由圖5可知，核桃蛋白的水解度隨酶添加量的增大而逐漸升高，之后呈現(xiàn)下降趨勢，雖然加酶量越多，生成的產(chǎn)物也就隨之增加，但是酶解反應(yīng)為可逆反應(yīng)，生成的產(chǎn)物積累到一定程度時，就會反過來抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致水解程度下降[21]；當(dāng)酶添加量為5%時，水解程度最佳，與其它濃度梯度之間差異性均顯著（p＜0.05），酶添加量7%、9%之間差異性不顯著，但均與1%、3%呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），后者兩兩之間也存在差異性（p＜0.05），綜上選擇酶的最適添加量為5%。

2.1.6 底物質(zhì)量濃度對水解度的影響

以復(fù)合酶質(zhì)量配比為2∶1、溫度為40℃、pH值為7.0、酶添加量為5%，按時間3 h，研究底物質(zhì)量濃度對水解度的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 底物質(zhì)量濃度對水解度的影響Fig.6 Effect of substrate mass concentration on hydrolysis degree

由圖6可知，底物質(zhì)量濃度能顯著影響核桃蛋白水解度，底物質(zhì)量濃度較低時，酶與底物不能充分接觸，反應(yīng)速率慢，導(dǎo)致水解程度較低；適當(dāng)?shù)牡孜镔|(zhì)量濃度有利于促進(jìn)酶解反應(yīng)向產(chǎn)物生成的方向移動[22]；而隨著底物質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，產(chǎn)物的生成量有所降低，其原因主要是，在底物質(zhì)量濃度較大時，要被催化的底物蛋白之間發(fā)生交聯(lián)聚合現(xiàn)象[23]，導(dǎo)致酶與蛋白之間接觸的幾率減小，溶解性降低，黏度增大，引起酶解反應(yīng)速率減緩，水解度下降[24]。底物質(zhì)量濃度30 g/L、40 g/L之間無顯著性差異，但水解度高于30 g/L，以上兩者與其余濃度之間呈現(xiàn)差異性顯著（p＜0.05），綜上，選擇底物的最適質(zhì)量濃度為40 g/L。

2.1.7 時間對水解度的影響

以復(fù)合酶質(zhì)量配比為2∶1、溫度為40℃、pH值為7.0、酶添加量為5%，底物質(zhì)量濃度為40 g/L，研究時間對水解度的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 時間對水解度的影響Fig.7 Effect of time on the hydrolysis degree

由圖7可知，核桃蛋白水解度隨著酶解時間的延長呈現(xiàn)先上升而后逐漸趨于平緩，在酶解剛開始時，酶的活力強(qiáng)，產(chǎn)物生成量少，有利于酶解傳質(zhì)過程的進(jìn)行[25]，所以核桃蛋白水解度上升較快，當(dāng)酶解時間為4 h時，蛋白酶的活性有所下降，此時游離多肽的增多對產(chǎn)物的生成抑制逐漸變大[26]，核桃蛋白水解程度逐漸變得緩慢趨于平衡。從差異性看可知，酶解時間4、5、6 h兩兩之間不存在差異性，均與2、3 h之間呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05）。綜上，選擇酶解時間為4 h。

2.2 正交優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以溫度（A）、pH值（B）、酶添加量（C）、底物質(zhì)量濃度（D）、時間（E）為試驗因素，蛋白水解度為考察指標(biāo)，采用L16（45）正交設(shè)計研究不同因素對核桃蛋白水解度的影響，正交試驗結(jié)果與分析見表2。

表2 核桃多肽制備工藝條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for walnut polypeptides preparation conditions optimization

由表2可知，以核桃蛋白水解度為評價指標(biāo)時，影響核桃多肽制備工藝的因素主次為A＞B＞D＞C＞E，即溫度＞pH值＞底物質(zhì)量濃度＞酶添加量＞時間，其最優(yōu)的試驗組合為A3B3C2D2E2，即溫度為40℃、pH值為7.2、酶添加量為5%、底物質(zhì)量濃度為40 g/L、時間為4 h，其中溫度對結(jié)果影響顯著（p＜0.05）；在正交試驗優(yōu)化最佳條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗，核桃蛋白水解度為26.72%。所以，確定復(fù)合酶水解核桃餅粕蛋白制備核桃多肽的最佳制備工藝為：復(fù)合酶最佳質(zhì)量配比為2∶1、溫度為40℃、pH值為7.2、酶添加量為5%、底物質(zhì)量濃度為40 g/L、時間為4 h。

3 結(jié)論

本文對中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行復(fù)合對雙酶水解核桃餅粕制備核桃多肽的影響因素進(jìn)行研究，通過單因素和正交試驗確定了核桃多肽最佳制備條件為：復(fù)合酶最佳質(zhì)量配比為2∶1、溫度為40℃、pH值為7.2、酶添加量為5%、底物質(zhì)量濃度為40 g/L、時間為4 h，在此條件下核桃餅粕中蛋白質(zhì)的水解度為26.72%。研究結(jié)果對核桃提質(zhì)增效、促進(jìn)核桃資源充分利用，助推貴州省核桃產(chǎn)業(yè)向前發(fā)展及助力國家脫貧攻堅具有重要的現(xiàn)實意義。

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