王宏飛 羅瓊, 李延鵬 同戈 張曉楠 朱啟運(yùn) 李慧敏 陳瑞愛(ài),

1.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司

2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

新城疫是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一，該病為OIE所規(guī)定的動(dòng)物必報(bào)疫病，也是我國(guó)規(guī)定的一類(lèi)動(dòng)物疫病，世界各國(guó)對(duì)該病的防控和研究一直十分重視。目前我國(guó)防控新城疫主要使用La Sota和Clone30兩種疫苗株，二者均屬于基因Ⅱ型；而田間流行的毒株主要是基因Ⅶ型NDV，所以上述兩種疫苗不能在臨床應(yīng)用上提供高效的免疫保護(hù)，雖然不出現(xiàn)嚴(yán)重臨床癥狀和死亡，但其組織器官在強(qiáng)毒感染下仍然會(huì)產(chǎn)生較嚴(yán)重的病變。而使用相同基因型的疫苗，不僅能有效降低攻毒后試驗(yàn)動(dòng)物的排毒率，而且能顯著減少喉氣管和泄殖腔中的病毒含量。使用與流行基因型一致的疫苗株來(lái)防控新城疫，對(duì)于有效控制疫病的發(fā)展具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。利用反向遺傳操作技術(shù)，將NDV的主要毒力基因F進(jìn)行突變，將G7株的F蛋白裂解位點(diǎn)（RRQKRF）突變?yōu)長(zhǎng)a Sota弱毒株的裂解位點(diǎn)（GRQGRL），并在此基礎(chǔ)上，將NP蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位第443-460位氨基酸進(jìn)行缺失，獲得雙突變株MG7，雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）是與當(dāng)前我國(guó)流行株匹配的新型新城疫滅活疫苗。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，利用雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）免疫SPF雞，20μl即可達(dá)到理想的保護(hù)效果，攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同日齡（10日齡和30日齡）SPF雞群均能抵抗流行的基因Ⅶ型強(qiáng)毒G7的攻擊，顯示出了該疫苗在控制我國(guó)新城疫的流行中具有廣闊的應(yīng)用前景，本研究利用新興土雞2號(hào)研究了雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）在商品雞中的免疫持續(xù)期，以期為制定合理的疫苗免疫程序提供參考。

一、材料和方法

1.疫苗。肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司中試生產(chǎn)的雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）。市售同類(lèi)疫苗為雞新城疫滅活疫苗（La Sota株）和基因Ⅶ型重組新城疫病毒滅活疫苗（A-Ⅶ株）。

2.試驗(yàn)雞。新興縣稔村溫氏家禽有限公司飼養(yǎng)的40日齡新興土雞2號(hào)。

3.驗(yàn)用強(qiáng)毒。NDV強(qiáng)毒北京株（CVCC AV1611）（購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）和基因Ⅶ型G7株（蘭州獸醫(yī)研究所和肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司保存）。

4.檢測(cè)用抗原。MG7抗原由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司保存。

二、試驗(yàn)方法

1.雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）免疫后的血清學(xué)檢測(cè)。取40日齡新興土雞2號(hào)（1-40日齡時(shí)均按雞場(chǎng)正常免疫程序進(jìn)行免疫）180只在隔離器飼養(yǎng)。在40日齡進(jìn)行新城疫疫苗免疫，劑量均為單次免疫劑量0.5 ml，第1組隨機(jī)抽取40只免疫雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株），第2組隨機(jī)抽取40只免疫市售La Sota疫苗，第3組隨機(jī)抽取40只免疫市售（A-Ⅶ株）疫苗，第4組為剩下60只作空白對(duì)照，在免疫前采血，免疫后的1、3、4、5、6、8個(gè)月分別對(duì)免疫雞群抽樣采血，每組采20份血樣，分離血清，用MG7抗原檢測(cè)HI抗體效價(jià)，確定試驗(yàn)疫苗的免疫持續(xù)期。

2.雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）免疫后的攻毒試驗(yàn)。40日齡新興土雞2號(hào)免疫后6個(gè)月，抽取方法2.1分組的免疫雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株），La Sota株疫苗、（A-Ⅶ株）疫苗組各20只；另從對(duì)照組抽取20只作為攻毒對(duì)照組，另外20只作為空白對(duì)照組。采集血清后，免疫組和攻毒對(duì)照組（各20只）再分成2組，每組10只，第1組每只雞肌肉注射新城疫病毒北京株（CVCC AV1611）0.5 ml(含 105.0ELD50)，第 2組每只雞肌肉注射新城疫基因Ⅶ型G7株強(qiáng)毒0.5 ml(含105.0ELD50)，觀察14日，記錄雞群的精神、采食、死亡等情況，攻毒后5日采集泄殖腔拭子接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，對(duì)病毒分離陰性的，應(yīng)在SPF雞胚再盲傳一次后進(jìn)行判定。方法如下：泄殖腔拭子加入2 ml PBS（含青鏈霉素8000單位），死亡的雞采集適量的氣管、脾、法氏囊等臟器進(jìn)行組織研磨，加入2 ml PBS（含青鏈霉素 8000 單位）。4℃，10000 rpm，離心 10min，取上清經(jīng)尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.2 ml。雞胚接種后于36℃～37℃孵育120 h，期間每日照胚兩次，棄去24 h內(nèi)死亡胚，24～120 h內(nèi)死亡雞胚取雞胚液，置于2℃～8℃保存。至120 h將存活雞胚置于2℃～8℃放置4～24 h，收集雞胚液。檢測(cè)收集到的雞胚液的HA效價(jià)，每個(gè)樣品接種的5枚雞胚中只要有1枚雞胚液的HA價(jià)不低于1∶16，即可判為病毒分離陽(yáng)性。對(duì)病毒分離陰性的樣品，再盲傳一次后再進(jìn)行判定。盲傳后仍為陰性者，方判為病毒分離陰性。

成活率=實(shí)驗(yàn)雞數(shù)量-新城疫死亡雞數(shù)量/實(shí)驗(yàn)雞數(shù)。

三、試驗(yàn)結(jié)果

在免疫前采血，免疫后的1、3、4、5、6個(gè)月分別對(duì)免疫雞群抽樣采血，每組采20份血樣，分離血清檢測(cè)HI抗體效價(jià)，使用MG7抗原作為檢測(cè)抗原，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，免疫后6個(gè)月滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）疫苗組HI抗體為6.4 log2，而市售同類(lèi)疫苗（A-Ⅶ株）疫苗組HI抗體為 5.2 log2，La Sota 株疫苗疫苗組 HI抗體僅為 4.1 log2。

表1 40日齡新興土雞2號(hào)免疫后效力結(jié)果（免疫 0.5 ml，N=20）

40日齡新興土雞2號(hào)免疫后6個(gè)月進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，攻毒對(duì)照組雞有明顯精神不振、嗜睡，拉黃綠色稀糞等典型新城疫臨床癥狀，3～5 d內(nèi)全部死亡。La Sota株疫苗組在肌肉注射新城疫基因Ⅶ型G7株強(qiáng)毒后，有兩只在第三天出現(xiàn)精神不振并在第5 d死亡，其余免疫攻毒組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異且全部健活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫后6個(gè)月，免疫組雞能有效抵御新城疫強(qiáng)毒G7株和北京株的攻擊（見(jiàn)表2）。用北京株攻毒，3種疫苗免疫后成活率均為100%，病毒分離結(jié)果，La Sota株疫苗免疫組全部陰性，（MG7株）和（A-Ⅶ株）疫苗免疫組各分離1個(gè)陽(yáng)性。用G7株攻毒，雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）和（A-Ⅶ株）疫苗免疫組成活率為100%，La Sota株疫苗免疫組成活率為80%，攻毒對(duì)照組全部死亡；攻毒后5日采集泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離，MG7免疫組病毒分離全部陰性，La Sota株疫苗2個(gè)陽(yáng)性，（A-Ⅶ株）疫苗免疫組1個(gè)陽(yáng)性，保護(hù)效果略優(yōu)于市售同類(lèi)產(chǎn)品。

表2 新興土雞2號(hào)免疫攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

四、討論

家禽養(yǎng)殖業(yè)用于防控新城疫的主要策略是疫苗接種，目前國(guó)內(nèi)外使用的疫苗株La Sota為基因II型，距今已有70多年的歷史，有研究表明La Sota疫苗株與目前流行的新城疫病毒株在遺傳上有很大程度分歧。本研究利用新興土雞2號(hào)研究了雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）在商品雞中的免疫持續(xù)期，同時(shí)以市售同類(lèi)疫苗雞新城疫滅活疫苗（La Sota株）和基因Ⅶ型重組新城疫病毒滅活疫苗（A-Ⅶ株）為對(duì)照，統(tǒng)一用MG7抗原進(jìn)行HI抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)La Sota株疫苗組抗體要低于MG7株疫苗組。本實(shí)驗(yàn)室前期研究分別以MG7株和La Sota株抗原對(duì)在SPF雞免疫M(jìn)G7和La Sota疫苗后獲得的陽(yáng)性血清進(jìn)行了交叉HI檢測(cè)。MG7株疫苗免疫血清抗體以MG7抗原進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，滴度為6.3 log2，以La Sota抗原進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，抗體滴度僅為為4.4 log2；La Sota株疫苗免疫血清以La Sota抗原進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，抗體滴度為5.9 log2，以MG7抗原進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，抗體滴度僅為4.7 log2（未發(fā)表資料）。結(jié)果表明，利用不同基因型新城疫抗原檢測(cè)，抗體相差1～2個(gè)滴度（log2）其抗原檢測(cè)同源血清時(shí)，抗體滴度較高。本研究結(jié)果顯示La Sota株疫苗抗體要低于MG7株疫苗的抗體，結(jié)果可能與異源抗原（MG7抗原）檢測(cè)有關(guān)，不同新城疫病毒基因型間抗原抗體交叉反應(yīng)的差異型也進(jìn)一步說(shuō)明需要研發(fā)新的基因型相匹配的新城疫疫苗。

常規(guī)使用劑量（0.5 ml）免疫后測(cè)定新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）在商品雞中的免疫持續(xù)期，免疫后抗體在一個(gè)月達(dá)到高峰，達(dá)到9.1 log2，隨后抗體逐漸衰減，6個(gè)月時(shí)HI抗體檢測(cè)值為6.4 log2，用田間分離的NDV基因VII型強(qiáng)毒G7和傳統(tǒng)強(qiáng)毒北京株分別進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，單劑量免疫后持續(xù)期可達(dá)6個(gè)月，6個(gè)月時(shí)攻毒對(duì)G7株均能提供100%保護(hù)，北京株強(qiáng)毒攻毒后也是100%的成活率。而La Sota株疫苗在G7株攻毒后僅能提供80%的保護(hù)。盡管常規(guī)ND疫苗免疫后能夠降低發(fā)病率和死亡率，但不能有效阻止雞只繼續(xù)感染和向環(huán)境中排毒，傳播疫病。本研究在MG7株免疫6個(gè)月后用基因Ⅶ型G7強(qiáng)毒株和進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，La Sota株免疫組在攻毒后有20%的雞分離到病毒；而MG7株免疫組在攻毒后未能檢測(cè)到病毒，表明在我國(guó)以基因Ⅶ型為流行株的環(huán)境下，相比傳統(tǒng)的La Sota疫苗，MG7株可更有效保護(hù)雞群并阻止排毒。

商品雞中的結(jié)果進(jìn)一步表明，新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）具有良好的預(yù)防新城疫的作用。為了獲得比較理想的保護(hù)效果，建議商品雞在免疫新城疫滅活標(biāo)記疫苗（MG7株）5個(gè)月時(shí)，加強(qiáng)免疫1次。

參考文獻(xiàn)（略）