王 軍，申田田，車 釗，董召榮，金 鑫，曹文超，吳小文，宋 賀*

（1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部黃淮南部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點試驗室，合肥 230036；2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193；3 合肥市廬江縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，合肥 231500）

自上世紀(jì)50年代以來，無機肥料因其高效、增產(chǎn)效果顯著、施用方便等特點快速成為我國農(nóng)田的主導(dǎo)肥源[1]。無機肥施用量從1950年的0.6萬噸增加到2015年的6022.6萬噸，增加了近萬倍，占當(dāng)前總肥源的90%[2–3]。近年來無機肥料在方便高效和增產(chǎn)的同時，也造成了農(nóng)田周圍水體污染、土壤結(jié)構(gòu)破壞和土壤酸化等一系列負(fù)面問題[4]。目前，在確保糧食產(chǎn)量的同時，土壤質(zhì)量的可持續(xù)性逐漸成為人們關(guān)注的焦點。有機肥的施用已被多次證實可以顯著改善土壤結(jié)構(gòu)；同時它含有豐富的養(yǎng)分，有利于維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的物料平衡[5–6]。然而，有機肥礦化速度較慢，單施有機肥對作物的增產(chǎn)效果不顯著[7]。因此有機和無機肥的合理配施，通常被認(rèn)為是保障作物產(chǎn)量和改善土壤質(zhì)量的有效途徑。由于有機和無機肥配合施用會改變土壤的理化性狀，并對微生物活性及豐度產(chǎn)生影響[8–9]，土壤養(yǎng)分循環(huán)也因此可能會受到深刻影響。

氮素循環(huán)是土壤養(yǎng)分循環(huán)中最重要的循環(huán)之一[10]，它與作物生產(chǎn)、環(huán)境污染密切相關(guān)。土壤中硝化和反硝化是氮素轉(zhuǎn)化的主要過程[11]。硝化過程是指氨 (NH3) 在好氧微生物作用下氧化成，隨后再氧化成的過程。其中從NH3氧化成是該過程的限速步驟，由氨氧化細(xì)菌 (AOB) 和氨氧化古菌 (AOA) 驅(qū)動[12–13]。不同無機和有機肥配比為AOA和AOB提供了不同的底物，因此可能會對它們的豐度和各自功能產(chǎn)生影響。此外，由于AOA和AOB對不同CO2濃度的響應(yīng)存在差異[14]，有機和無機肥配比在改變土壤CO2排放量[15–16]的同時，也可能會對AOA和AOB生長和活性產(chǎn)生影響。當(dāng)前的研究主要集中在單施無機肥或有機肥對氨氧化微生物豐度及功能的影響，而不同比例配施對其豐度和功能的影響未見報道。

反硝化過程是反硝化微生物將環(huán)境中的經(jīng)多種酶催化逐步還原為氣態(tài)產(chǎn)物 (NO、N2O和N2) 的過程。其中由nirK和nirS基因編碼的亞硝酸還原酶首次將土壤中可溶態(tài)氮轉(zhuǎn)化成一般作物難以利用的氣態(tài)氮素[17]，是土壤氮素?fù)p失的主要過程，也是當(dāng)前研究的重點。此外，N2O還原酶與痕量氣體N2O的排放密切相關(guān)，也受到廣泛的關(guān)注[18]。有機肥直接為反硝化細(xì)菌提供碳源并促進其生長。同時，有機肥的施入也有利于其他微生物的生長，增加CO2排放量，加快氧氣的消耗，這為反硝化作用提供良好的低氧微域環(huán)境[19]。反硝化微生物是異養(yǎng)微生物，有機物為它們提供電子還原氧化態(tài)的氮素，從而在厭氧條件下進行無氧呼吸，維持自身能源和生長需求[17]。不同有機肥和無機氮素配比，既提供了反硝化微生物的電子供體，又提供了電子受體，而不同供體和受體比例差異如何影響反硝化微生物豐度和功能，目前尚不清楚。

本研究依托江淮地區(qū)的3年定位試驗，通過田間原位取樣和室內(nèi)培養(yǎng)，利用分子微生物學(xué)和生物化學(xué)等方法，重點研究有機和無機肥不同配比對該地區(qū)主要土壤 (黃褐土) 硝化和反硝化微生物豐度及其功能的影響，并探討其變化的可能機理，以期為該地區(qū)制定合理的施肥制度、減少氮肥損失及提高氮素利用效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗點概況

試驗點位于安徽省合肥市安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)翠園試驗基地 (N 31°87′、E 117°25′)。該地區(qū)年平均溫度為15.7℃，降雨量998 mm。土壤類型為黃褐土，試驗開始前，0—20 cm土壤全氮1.8 g/kg、有機質(zhì)21.0 g/kg、碳氮比6.8、堿解氮108.7 mg/kg、全磷0.4 g/kg、全鉀21.2 g/kg、有效磷10.8 mg/kg、速效鉀149.3 mg/kg、油菜籽餅肥pH為 4.9。

1.2 試驗布置與樣品采集

試驗始于2014年6月初。采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置6種不同的施肥方式：CK (對照，不施氮肥)、T1 (單施無機肥)、T2 (無機肥∶有機肥 = 2∶1)、T3(無機肥∶有機肥 = 1∶1)、T4 (無機肥∶有機肥 =1∶2)、T5 (單施有機肥)。每個施肥處理總氮量一致，配施處理的比例是以氮計算，各小區(qū)磷鉀肥的施用量相同。小區(qū)面積為14.4 m2，共3次重復(fù)。玉米季和小麥季的總施氮量為 240 kg/hm2，玉米基施P2O5107.1 kg/hm2、K2O 112.5 kg/hm2；小麥基施P2O5150 kg/hm2、K2O 120 kg/hm2。玉米氮肥分基肥、穗肥兩次施用，比例為3∶7；小麥氮肥分基肥、拔節(jié)肥兩次施用，比例為4∶1。無機氮肥采用尿素，有機肥采用油菜籽餅肥，有機肥和磷鉀肥作基肥一次施入，施肥方式以及相關(guān)農(nóng)藝管理措施每年保持一致。玉米和小麥分別于每年6月初和10月底播種。

試驗取樣在2017年3月7日，于小麥拔節(jié)期，在每個小區(qū)行間“S”形取0—20 cm的土樣5～6鉆，四分法取約1 kg裝入封口袋內(nèi)。帶回室內(nèi)過2 mm篩，分兩部分儲藏，一部分放在–20℃冰箱儲藏，用于硝化和反硝化功能基因分子定量試驗；另一部分放在4℃冰箱儲藏，用于培養(yǎng)試驗和土壤理化性狀的測定。

1.3 硝化勢 (NP) 和乙炔抑制后硝化勢的恢復(fù)(RNP)

硝化勢和乙炔抑制后硝化勢的恢復(fù)采用懸浮液法[20–21]測定。

硝化勢的測定：各小區(qū)稱取鮮土樣5 g，分別加入50 mL提前配制的液體培養(yǎng)基 (1.5 mmol/L)，30℃恒溫振蕩48 h (180 r/min)。分別于第6、12、24、36、48 h取樣，每次吸取4 mL懸浮液離心，將上清液用于、分析。、用連續(xù)流動分析儀測定 (德國，AA3全自動連續(xù)流動分析儀)。硝化勢用單位時間內(nèi)產(chǎn)生的和總量表示。

乙炔抑制后硝化勢的恢復(fù)：各小區(qū)取兩組5 g鮮土放入兩組120 mL培養(yǎng)瓶中，加入50 mL的液體培養(yǎng)基 (1.5 mmol/L)，并用微型注射器添加體積比為0.025%的乙炔，30℃恒溫振蕩培養(yǎng) 6 h。6 h后，用抽真空器抽去乙炔。其中一組添加對細(xì)菌蛋白質(zhì)合成具有專一性抑制作用即抑制氨氧化細(xì)菌 (AOB)的抗生素類物質(zhì)—卡那霉素 (Kanmycin，濃度為800 μg/mL)。每12 h測一次硝化勢，測至第48 h。其中添加卡那霉素的培養(yǎng)瓶測的是氨氧化古菌的硝化勢(RNPAOA)，不添加卡那霉素的為AOA和AOB總的硝化勢 (RNPtotal)，RNPAOB= RNPtotal–RNPAOA。

1.4 反硝化能力、N2O/(N2O+N2) 產(chǎn)物比和土壤呼吸測定

反硝化能力的測定主要按照?imek等[22–22]的標(biāo)準(zhǔn)方法。各小區(qū)取兩份相當(dāng)于10 g干土的鮮土放入兩組120 mL培養(yǎng)瓶中，向瓶中加入5 mL濃度為42.9 mmol/L的KNO3溶液，隨后密封，并用氦氣反復(fù)沖洗4次。其中一組注入10 mL乙炔，另一組不注入。注乙炔的培養(yǎng)瓶，用裝有少量水、沒有活塞的注射器插入瓶塞用來平衡瓶內(nèi)氣壓。在24 h和48 h后，兩組都抽取5 mL氣體上氣相色譜測定N2O和CO2濃度 (美國Agilent，GC-7890A)。抽完氣體后為防止氣壓變低，用相同體積的氦氣進行補氣平衡。根據(jù)24 h到48 h N2O和CO2濃度變化率計算反硝化能力、N2O/(N2O+N2) 和土壤呼吸[22]。其中添加乙炔的培養(yǎng)瓶N2O氣體變化率是反硝化能力，代表反硝化總量N2O+N2的產(chǎn)生率；不添加乙炔的培養(yǎng)瓶N2O氣體變化量代表反硝化過程N2O排放率。

1.5 土壤微生物總DNA提取和功能基因熒光定量

取0.5 g土樣，通過土壤DNA提取試劑盒 (Fast DNASPIN Kit for Soil，美國Q-BIO gene公司)，按試劑盒操作步驟，提取土壤微生物總DNA，總提取量為80 μL，洗脫液放入–20℃冰箱儲藏。氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌功能基因amoA定量PCR采用Mx3000P實時熒光定量PCR系統(tǒng) (Stratagene，USA)，選擇amoA1F/amoA2R和Arch-amoAF/ArchamoAR引物分別擴增氨氧化細(xì)菌和古菌。選用25 μL的PCR反應(yīng)體系，包含：12.5 μL的2 × SG Green qPCR Mix，上下游引物各 0.5 μL (10 μmol)，0.5 μL DNA模板，剩下的用雙蒸水補齊至25 μL。氨氧化細(xì)菌反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸60 s，35個循環(huán)。氨氧化古菌PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性45 s、53℃退火60 s、72℃延伸60 s，30個循環(huán)。分別選取nirScd3aF/nirSR3cd、nirK1F/nirK5R和nosZ1F/nosZ1R 3對引物擴增反硝化菌功能基因nirS、nirK和nosZ。50 μL反應(yīng)體系包括25 μL SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa，日本)，引物各 1 μL(10 μmol/L)，DNA 模板1 μL，其余的用滅菌高純水補齊。nirS擴增程序為：95℃ 2 min；95℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)。nirK的PCR反應(yīng)程序為：94℃ 3 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)。nosZ的PCR反應(yīng)程序為：95℃ 3 min；94℃ 20 s，59℃ 20 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán)。質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備主要依照王曉輝[24]的方法。

1.6 土壤理化性狀測定

土壤pH由土壤pH計測定，水土比為5∶1。有機質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測定；全氮采用高錳酸鉀還原，濃H2SO4消煮，凱氏定氮儀定氮；全磷全鉀用氫氧化鈉堿融；堿解氮用堿解擴散吸收法；有效磷使用碳酸氫鈉—分光光度計法測定；速效鉀采用醋酸銨—火焰光度計測定；土壤可溶性有機碳(DOC) 用0.5 mol/L K2SO4浸提30 min，過濾后用可溶性有機碳分析儀 (Analytik Jena，Germany) 測定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)用SPSS19分析軟件進行單因素方差和相關(guān)性分析。圖中數(shù)據(jù)為處理平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。用Microsoft Excel 2007作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機和無機肥配比對土壤理化性狀的影響

從表1可以看出，不同有機肥無機肥配比處理對土壤基礎(chǔ)理化性狀的影響不盡相同。三年的定位試驗，處理間全氮、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀含量的差異并不顯著。但處理間的土壤pH已經(jīng)產(chǎn)生了一定差異，與對照處理相比，其他施肥處理有下降的趨勢；其中無機肥∶有機肥 = 2∶1的處理 (T2)顯著低于對照處理。全施有機肥處理的土壤有機質(zhì)和可溶性有機碳含量顯著高于對照，與其他不同比例配施處理差異不顯著。此外，全施有機肥處理堿解氮含量最高，顯著高于T2處理和對照處理，但與其他處理之間差異不顯著。

2.2 不同有機和無機肥配比對硝化勢和氨氧化細(xì)菌及古菌貢獻率的影響

由圖1可知，與對照不施氮相比，長期施氮會顯著增加土壤的硝化勢。單施無機肥處理硝化勢最高，達(dá)到70.0 mg/(kg·d)，是對照不施氮的5.4倍，其次是單施有機肥處理。在所有施肥處理中，T3處理 (無機∶有機 = 1∶1) 的硝化勢最低，并且顯著低于T1處理。單施無機肥和有機肥處理之間沒有顯著差異。

由圖2可知，不同處理中，AOA的硝化潛勢貢獻率為36.6%～79.7%?？梢娤趸啪邳S褐土氮素轉(zhuǎn)化過程中占十分重要的地位。單施無機肥處理的AOA在硝化作用中占主導(dǎo)地位，AOA硝化貢獻率高達(dá)79.7%。未施氮肥CK和單施有機肥T5處理中，AOB在土壤硝化作用中占優(yōu)勢地位，AOB的硝化貢獻率分別為63.4%和59.9%。與單施有機肥相比，隨著無機肥所占比例的增加，AOA的硝化相對貢獻率有增加趨勢。同樣，增加有機肥比重會提高AOB的相對貢獻率。

表 1 有機和無機肥配比對土壤理化性狀的影響Table 1 Effects of different ratios of organic and inorganic fertilizers on soil physical and chemical properties

圖 1 不同有機和無機肥配比對土壤硝化勢的影響Fig. 1 Nitrification potential under different ratios of organic and inorganic fertilizers

圖 2 不同有機和無機肥配比對氨氧化細(xì)菌及古菌硝化貢獻率的影響Fig. 2 Relative contribution of AOA and AOB under different ratios of organic and inorganic fertilizers

2.3 不同有機和無機肥配比對氨氧化細(xì)菌和古菌豐度的影響

由圖3看出，各處理的氨氧化細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)分別是氨氧化古菌的23.1～34.8倍，在豐度上，黃褐土中的氨氧化細(xì)菌占優(yōu)勢地位。和不施氮肥相比，有機和無機肥均會顯著增加AOB-amoA基因拷貝數(shù)；但有機肥、無機肥以及不同配比間其豐度差異并不顯著。與對照處理相比，單施無機肥會顯著增加AOA-amoA的拷貝數(shù)。與單施有機肥處理相比，增加無機肥比重有增加AOA-amoA基因拷貝數(shù)的趨勢。

2.4 不同有機和無機肥配比對土壤反硝化能力、N2O/(N2O+N2) 和土壤呼吸的影響

由圖4可知，隨著有機肥投入量的增加，土壤反硝化能力和土壤呼吸都呈增加趨勢。其中單施有機肥處理的反硝化能力和土壤呼吸顯著高于其他處理，3個配比處理和單施無機肥處理間差異不顯著。

由圖5可知，各處理N2O/(N2O+N2) 產(chǎn)物比排序依次為：T4 ＞ CK ＞ T1 ＞ T3 ＞ T2 ＞ T5。其中無機∶有機 = 1∶2的T4處理最高，產(chǎn)物比達(dá)到77%。單施有機肥處理最低，顯著低于對照不施氮肥處理和T4處理。

2.5 不同有機和無機肥配比對反硝化菌群豐度的影響

圖 3 不同有機和無機肥配比對氨氧化細(xì)菌和古菌豐度的影響Fig. 3 Abundances of AOB and AOA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

圖 4 不同有機和無機肥配比對土壤反硝化能力和土壤呼吸的影響Fig. 4 Denitrification capacity and soil respiration under different ratios of organic and inorganic fertilizers

圖 5 不同有機和無機肥配比對N2O/(N2O+N2) 產(chǎn)物比的影響Fig. 5 N2O/(N2O+N2) ratios under different ratios of organic and inorganic fertilizers

由圖6可知，供試土壤nosZ基因拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于nirK和nirS基因拷貝數(shù)，前者比后者高出1～2個數(shù)量級。施肥顯著增加了nirS型反硝化菌豐度 (圖6A)。nirK基因拷貝數(shù)隨著有機肥投入量的增加有減少的趨勢 (圖6A)，而nirS和nosZ型基因拷貝數(shù)卻有增加的趨勢。與單施無機肥處理相比，有機肥與無機肥施用配比2∶1以上時，會顯著增加nosZ拷貝數(shù)(圖 6B)。

2.6 不同有機和無機肥配比試驗中測定變量之間的相關(guān)性分析

由表2可知，pH與AOB-amoA基因拷貝數(shù)和nirS基因拷貝數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān) (r = –0.574和–0.481，P ＜ 0.05)。氨氧化古菌對硝化勢的相對貢獻率(RNPAOA/RNPtotal) 與氨氧化古菌豐度呈極顯著正相關(guān)(r = 0.748，P ＜ 0.01)。反硝化能力與土壤呼吸呈極顯著相關(guān) (r = 0.677，P ＜ 0.01)，同時兩者也與nirS和nosZ型反硝化菌豐度呈極顯著正相關(guān) (r = 0.685、0.816、0.644和 0.833，P ＜ 0.01)，而與 nirK 型反硝化菌的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。同時，反硝化能力與土壤有機質(zhì)和可溶性有機碳含量呈極顯著正相關(guān)(r = 0.634和0.593，P ＜ 0.01)，與堿解氮含量呈顯著正相關(guān) (r = 0.564，P ＜ 0.05)。N2O/(N2O+N2) 產(chǎn)物比與各變量均無顯著相關(guān)性。

圖 6 不同有機和無機肥配比對nirK、nirS和nosZ拷貝數(shù)的影響Fig. 6 Effects of different ratios of organic and inorganic fertilizers on nirK, nirS, and nosZ copies

表 2 不同有機和無機肥配比測定變量間相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis among measured variables in treatments with different ratios of organic and inorganic fertilizers

3 討論

3.1 不同有機和無機肥配比對氨氧化微生物、硝化貢獻率及硝化潛勢的影響

氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌驅(qū)動土壤硝化過程，在土壤生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)中起到重要的作用[25]。本研究表明，與不施氮肥相比，無機肥和有機肥的投入均會增加AOA和AOB的種群豐度，這與其他報道一致[26–27]。但有機肥與無機肥對AOA和AOB的影響存在顯著差別 (圖3)。有機肥、無機肥和不同配比對AOB的豐度并沒有顯著的影響，但隨著無機肥所占比例的增加，AOA的豐度有顯著增加的趨勢。對硝化潛勢相對貢獻率的測定 (圖2) 也表明，單施無機肥處理的AOA硝化貢獻率高達(dá)79.7%，顯著高于單施有機肥處理和無機∶有機 = 1∶2的處理。相關(guān)分析也表明，RNPAOA/RNPtotal與AOA-amoA基因拷貝數(shù)呈極顯著正相關(guān) (表2)。由此說明增加無機肥投入比例有利于提高AOA的豐度和相應(yīng)的硝化貢獻率。這可能和氨氧化古菌具有脲酶基因，能夠利用尿素生長，并在自然環(huán)境里通過尿素水解進行氨氧化作用有關(guān)[28]。同時，有研究表明[29–30]，AOA在低CO2濃度下具有更高效的固定途徑，與有機肥處理相比，無機肥產(chǎn)生的CO2量相對較低，所以這也可能有利于AOA的生長。與不施氮肥對照處理相比，施肥顯著提高土壤硝化勢，這與前人研究結(jié)果一致[31–35]。單施無機肥和有機肥的硝化勢高于其它三個配比處理，其中無機∶有機 = 1∶1處理的硝化潛勢最低，與單施無機肥處理差異顯著。硝化作用由AOA和AOB共同驅(qū)動，本試驗中無機∶有機 = 1∶1處理的AOA、AOB豐度之和在所有施肥處理中是最低的，這可能是該處理硝化潛勢最低的原因。與單施無機肥或有機肥處理相比，有機和無機肥適當(dāng)配施可降低土壤硝化勢。盡管施用有機肥或無機肥均能提高硝化勢，但提高的機理存在差異。無機肥主要通過提高脲酶活性、促進尿素水解提高硝化勢；而有機肥則是通過礦化作用產(chǎn)生氨而促進硝化作用[36–37]。綜上所述，增加無機肥的比重有利于AOA豐度的提高并增大硝化相對貢獻率，而增大有機肥比重則相應(yīng)提高AOB的硝化相對貢獻率。

3.2 不同有機和無機肥配比對反硝化能力、N2O/(N2O+N2) 產(chǎn)物比及反硝化菌的影響

有機肥添加為土壤提供了大量的碳源，為反硝化微生物提供了豐富的電子供體，因此施用有機肥可能會對反硝化過程產(chǎn)生一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)單施有機肥處理的反硝化能力和土壤呼吸都顯著高于單施無機肥處理，然而3個配比處理顯著低于單施有機肥處理，說明有機和無機配施能夠有效地減少土壤反硝化損失。研究表明，土壤中可利用的碳源是影響反硝化作用的主要原因[26,32,38]。本研究也發(fā)現(xiàn)反硝化能力和土壤可溶性有機碳存在極顯著正相關(guān)關(guān)系 (表2)。施用有機肥為異養(yǎng)生長的反硝化菌提供了豐富的碳源[39]。同時，有機肥有利于提高土壤微生物活性，從而加快氧氣的消耗，這為反硝化作用提供良好的低氧微域環(huán)境[19,40]。本試驗中單施有機肥處理的可溶性有機碳含量是最高的 (表1)，而配施則可以有效減少可溶性有機碳含量，從而降低土壤反硝化損失。

反硝化菌群直接參與反硝化過程，其豐度變化也可能對反硝化能力產(chǎn)生一定影響[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同比例的有機和無機肥配施對nir基因產(chǎn)生不同的影響，無機肥能促進nirK型反硝化菌生長，有機肥能促進nirS和nosZ型反硝化菌生長。羅希茜等[42]也發(fā)現(xiàn)長期施用無機氮肥會使nirK基因的反硝化菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，而對nirS基因群落結(jié)構(gòu)則無顯著影響。相關(guān)分析 (表2) 表明，nirS型反硝化菌的豐度與反硝化能力、土壤呼吸、有機質(zhì)、堿解氮含量呈極顯著正相關(guān)。相對于nirK型菌，nirS型反硝化菌通常更喜歡有機碳和營養(yǎng)元素含量較高的環(huán)境[43]。有機肥的投入可以提高土壤中有機碳和速效氮的量[36]，因此有利于nirS型菌的生長。反硝化能力與nirS型和nosZ反硝化菌的豐度呈極顯著正相關(guān)，而與nirK型反硝化菌沒有相關(guān)性 (表2)，由此可見，nirS和nosZ型反硝化菌而非nirK型菌對反硝化能力起主要的驅(qū)動作用。

nosZ型菌參與反硝化末端N2O還原，與N2O/(N2O+N2) 產(chǎn)物比有關(guān)。反硝化作用不僅造成氮肥的損失，直接影響氮肥的有效利用，而且還會產(chǎn)生一部分痕量氣體N2O，造成溫室效應(yīng)以及破壞臭氧層[44–45]。本研究發(fā)現(xiàn)nosZ型反硝化菌豐度與N2O/(N2O+N2) 產(chǎn)物比之間存在一定負(fù)相關(guān)關(guān)系 (表2)，可見提高nosZ型反硝化微生物豐度是降低土壤N2O/(N2O+N2) 產(chǎn)物比的有效途徑。隨著有機肥施用量的提高，nosZ型反硝化菌的豐度有顯著增加的趨勢，但N2O/(N2O+N2) 產(chǎn)物比卻呈現(xiàn)出先下降后升高再下降的趨勢 (圖5，圖6B)。由此可見，最終影響N2O/(N2O+N2) 產(chǎn)物比的不僅是nosZ型反硝化菌的豐度，也和其他因素有關(guān)，例如nosZ基因的表達(dá)量及N2O還原酶的活性。在未來的研究中，在RNA水平上nosZ的表達(dá)量和相關(guān)酶活性是研究的重點，應(yīng)該得到進一步加強。

4 結(jié)論

有機和無機肥配施對硝化和反硝化過程產(chǎn)生不同程度的影響。與單施有機肥或無機肥相比，有機和無機肥適當(dāng)配施可降低土壤硝化勢。無機肥會增加AOA的豐度和硝化貢獻率，而有機肥則有利于

AOB的硝化貢獻率。有機和無機肥不同配比可以調(diào)控AOA和AOB在硝化過程中所起的作用。單施有機肥會增加反硝化損失，添加無機肥進行配比，會降低反硝化損失。無機肥能促進nirK型反硝化菌生長，有機肥能促進nirS和nosZ型反硝化菌生長。

nirS和nosZ型反硝化菌而非nirK型菌對反硝化能力起主要的驅(qū)動作用。

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