周健飛，武云杰，薛 剛，徐世曉，彭玉富，楊鐵釗*

（1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002；2 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州 450000）

氮素是作物生長發(fā)育和品質(zhì)形成的重要因素，氮代謝特性在不同基因型間存在差異[1]。我國目前植煙地區(qū)氮肥用量普遍偏多，如遭遇生育后期較多雨水，土壤中緩效氮和礦化氮釋放量增加，使土壤中有效態(tài)氮素含量提高，背離“煙株長成肥退勁”的需肥規(guī)律。此外，造成不耐氮肥品種貪青晚熟，影響煙葉碳氮代謝轉(zhuǎn)化，形成難以烘烤的“黑暴”煙葉，降低烤煙品質(zhì)。因此，深入研究氮素利用生理生化機制，對于篩選和培育氮素適應(yīng)范圍廣的煙草品種具有重要指導(dǎo)意義。

不同品種間氮效率差異主要圍繞作物的葉綠素含量、根系活性和吸收面積以及硝酸還原酶活性等生理指標(biāo)來研究[2–3]。分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究結(jié)果表明，谷氨酰胺合成酶 (GS) 同工酶基因表達(dá)及其活性在植物的氮素轉(zhuǎn)運和分配中具有重要作用，GS同工酶的相對比例可能是影響氮素利用效率的原因之一[4]。

高等植物的GS基于亞細(xì)胞定位不同可以分為兩類，一類為多基因編碼的GS1，定位于胞液中；另一類為一個核基因編碼的GS2，存在于葉綠體中。GS1的功能是對葉片衰老時的氮源進(jìn)行轉(zhuǎn)移及再利用，而GS2主要對光呼吸、硝酸還原產(chǎn)生的氨進(jìn)行同化[5]。目前對GS同工酶的研究逐漸成為改良作物氮代謝效率的熱點。Hirel等利用層析技術(shù)對玉米葉片的GS同工酶進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)功能葉中起主導(dǎo)作用的是GS2同工酶，且隨著葉片的衰老GS2同工酶活性逐漸降低，而GS1同工酶活性逐漸增高[6]。Fei等通過對GS1-5轉(zhuǎn)基因大豆的研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)GS1-5的大豆促進(jìn)了氮素的吸收與同化，且葉片的GS酶活性、干物質(zhì)重量和氮含量均有提高[7]。Li等對266個中國小麥品種進(jìn)行了單倍體分析，發(fā)現(xiàn)了TaGS2基因在小麥染色體上的定位，并發(fā)現(xiàn)了4個可以賦予小麥幼苗更好農(nóng)藝性狀和更好氮效率的單倍型，這也表明了GS2在氮素同化功能中的作用[8]。以上研究結(jié)果均說明，GS基因的表達(dá)對于植物氮素利用效率的調(diào)控具有重要作用。硝酸還原酶 (NR) 受誘導(dǎo)并將其轉(zhuǎn)化為隨后經(jīng)亞硝酸還原酶轉(zhuǎn)變?yōu)?。趙小強等[10]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)外源NR基因的超表達(dá)可以顯著提高冬性小麥的籽粒重量和籽粒蛋白質(zhì)含量。

大量研究結(jié)果集中于糧食作物中GS同工酶和NR等在轉(zhuǎn)錄水平和酶活性上的變化動態(tài)以及不同氮效率品種間的差異。但不同烤煙品種的氮代謝酶活性和基因表達(dá)差異及其與相關(guān)生理指標(biāo)的聯(lián)系，以及對氮效率的影響尚未見報道。本試驗選用成熟期氮低效烤煙品種豫煙10號[11]、中等氮效率品種K326[12]和成熟期氮高效品種NC89[13]為試驗材料，采用熒光定量PCR和質(zhì)外體提取等方法，探索GS同工酶、NR基因表達(dá)豐度與相關(guān)生理指標(biāo)的關(guān)系，進(jìn)一步研究不同氮效率品種成熟期氮素代謝機制和分子機理，以期為篩選氮素適應(yīng)范圍廣的烤煙品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

盆栽試驗于2017年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)進(jìn)行。參試烤煙品種為豫煙10號、K326和NC89 (成熟期氮效率為 NC89 ＞ K326 ＞ 豫煙 10 號[11–13])。供試土壤為黃色壤土 (取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū))，pH值為7.82，有機質(zhì)9.71 g/kg、全氮0.94 g/kg、速效氮69.25 mg/kg、有效磷26.83 mg/kg、速效鉀95.67 mg/kg。盆栽采用聚乙烯塑料盆，內(nèi)徑為35 cm，高度30 cm，裝土18.0 kg。每盆植煙1株，每個品種60盆，重復(fù)3次。每盆施用純氮4 g，N∶P2O5∶K2O為1∶2∶3，常規(guī)水分管理。

在葉齡35、45、55、65、75 d (以幼葉長1 cm、寬0.5 cm時作為葉齡第1天) 取第12片葉 (自下向上數(shù))，用于測定煙葉氮代謝酶基因NtGS1、NtGS2和NtNit的表達(dá)豐度，同時測定葉片及質(zhì)外體相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 將取回的新鮮煙葉樣品用液氮研磨后，根據(jù)Trizol試劑盒 (Invitrogen) 使用說明書提取總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整度。cDNA的合成采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行 (TaKaRa公司)。

1.2.2 氮代謝酶qRT-PCR引物設(shè)計及過程引物 根據(jù)NCBI上已登錄的相關(guān)基因運用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計 (表1)，由Invitrogen Biotechnology Co., LTD公司合成，選擇煙草beta-Actin作為內(nèi)參基因。實時熒光定量PCR在Life technologies公司的StepOneTMReal-Time PCR儀上完成，每個樣品均作3個復(fù)孔，使用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行(TaKaRa公司)。反應(yīng)參數(shù)：95℃ 60 s，1個循環(huán) (預(yù)變性)；95℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 45 s，共 40 個循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后利用熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性，從60℃緩慢升溫至95℃，每20 s升溫1℃。10 μL反應(yīng)體系包括2 × qPCR Mix 5 μL，引物工作液 (2.5 μmol/L) 1.0 μL，模板 1.0 μL，ddH2O 2.8 μL 和 Rox 0.2 μL。采用 2–ΔΔCT法分析基因的相對表達(dá)量。

1.2.3 酶活性測定 谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性以1mg/min粗蛋白催化產(chǎn)生的γ-谷氨酰異羥肟酸數(shù)量來表示[14]。硝酸還原酶 (NR) 活性測定采用活體法進(jìn)行[15]。

1.2.4 其他生理指標(biāo)測定方法 葉片濃度采用改良的茚滿三酮法測定，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定，總氮含量采用凱氏定氮法測定[15]。質(zhì)外體濃度和質(zhì)外體pH測定參考文獻(xiàn)[16]的方法。氨氣補償點的計算參考文獻(xiàn)[17]的方法。葉片氨氣揮發(fā)量采用武云杰等[18]的方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016計算各測定指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行方差分析，對各處理差異進(jìn)行LSD多重比較，最后進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙葉片氮代謝酶基因表達(dá)動態(tài)變化

由圖1可知，NtGS1表達(dá)豐度在葉齡35 d時非常低，葉齡45 d始NtGS1表達(dá)豐度大幅上調(diào)，與35 d相比，NC89、K326和豫煙10號分別增加了5.47、4.52和2.53倍；在葉齡55 d時持續(xù)上調(diào)并達(dá)到最大值，隨后該基因逐漸下調(diào)表達(dá)。NtGS1表達(dá)豐度變化趨勢在品種間表現(xiàn)一致。說明烤煙中部葉在葉齡45 d時已完成生長發(fā)育而進(jìn)入成熟階段，GS1的基因被啟動，氮運轉(zhuǎn)進(jìn)入分配再利用階段，在葉齡75 d時煙葉已進(jìn)入衰老晚期。3個參試品種在葉齡45 d、55 d和65 d時 NtGS1表達(dá)豐度差異均達(dá)極顯著水平，順序為 NC89 ＞ K326 ＞ 豫煙 10 號。

表 1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primers for qRT-PCR

圖 1 不同品種烤煙葉片NtGS1、NtGS2和NtNit基因表達(dá)豐度動態(tài)變化Fig. 1 Dynamic changes of gene expression of NtGS1, NtGS2 and NtNit of flue-cured tobacco leaves

NtGS2表達(dá)豐度在葉齡35 d時最高，45 d時大幅下調(diào)，降幅非常劇烈。葉齡45 d到75 d之間依然趨于下調(diào)表達(dá)，但是幅度較緩。葉齡45 d時NC89的NtGS2表達(dá)豐度分別為K326和豫煙10號的1.07倍和1.39倍。45～65 d始終表現(xiàn)為NC89 ＞K326 ＞ 豫煙10號，且差異達(dá)到極顯著水平。

NtNit表達(dá)豐度變化趨勢和NtGS2相似，在葉齡35～45 d大幅下調(diào)表達(dá)，隨后趨于平緩。不同氮效率品種35～65 d之間NtNit表達(dá)豐度均表現(xiàn)為NC89 ＞ K326 ＞ 豫煙 10 號，且 NC89 和豫煙 10 號差異始終達(dá)到極顯著水平。

2.2 葉片氮代謝酶活性動態(tài)變化

由圖2可知，GS活性在葉齡35 d最高，隨后整體呈下降趨勢。與NC89相比，豫煙10號和K326的GS活性下降非常劇烈。45 d時NC89、K326和豫煙10號分別下降18.8%、28.3%和62.5%。45～65 d始終表現(xiàn)為NC89 ＞ K326 ＞ 豫煙10號，且差異達(dá)到極顯著水平。NR活性在葉齡35 d最高，隨后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。在葉齡35～65 d時各參試品種均表現(xiàn)為NC89 ＞ K326 ＞ 豫煙10號且品種間差異達(dá)到極顯著水平。

2.3 葉片濃度、總氮和可溶性蛋白含量的動態(tài)變化

由圖3可知，GS活性在葉齡35 d最高，隨后整體呈下降趨勢。與NC89相比，豫煙10號和K326的GS活性下降非常劇烈。45 d時NC89、K326和豫煙10號分別下降18.8%、28.3%和62.5%。45～65 d始終表現(xiàn)為NC89 ＞ K326 ＞ 豫煙10號，且差異達(dá)到極顯著水平。NR活性在葉齡35 d最高，隨后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。在葉齡35～65 d時各參試品種均表現(xiàn)為NC89 ＞ K326 ＞ 豫煙10號且品種間差異達(dá)到極顯著水平。

圖 2 不同品種烤煙葉片氮代謝酶活性動態(tài)變化Fig. 2 Dynamic changes of enzyme activities related to nitrogen metabolism of flue-cured tobacco leaves

圖 3 不同品種烤煙葉片濃度、總氮和可溶性蛋白含量的變化動態(tài)Fig. 3 Dynamic changes of the contents of total nitrogen and soluble protein of flue-cured tobacco leaves

煙葉總氮含量可以體現(xiàn)葉片總體的氮素水平。葉片總氮含量表現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢。35 d時各品種之間差異不大, 45～65 d均表現(xiàn)為NC89 ＞ K326 ＞豫煙10號，差異達(dá)到極顯著水平。葉齡65 d時豫煙10號總氮含量僅為0.81%，NC89和K326的總氮含量分別是其2.33倍和2.09倍?？扇苄缘鞍椎淖兓厔莺涂偟嗨?，但是下降幅度較緩。

2.4 葉片質(zhì)外體相關(guān)生理指標(biāo)和氨氣揮發(fā)量的動態(tài)變化

質(zhì)外體的NH4+是葉片氨氣揮發(fā)的重要來源，質(zhì)外體pH值越高越有利于氨氣揮發(fā)[19]。由圖4可以看出，質(zhì)外體NH4+濃度和質(zhì)外體pH均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，質(zhì)外體NH4+濃度于55 d達(dá)到最高點，隨后大幅下降，在45～65 d間始終表現(xiàn)為豫煙10號 ＞ K326 ＞ NC89，其中豫煙10號增長幅度非常大。質(zhì)外體pH在45 d達(dá)到最大值，隨后開始下降。45～65 d豫煙10號質(zhì)外體pH始終大于NC89和K326，差異達(dá)到極顯著水平。

氨氣補償點由質(zhì)外體NH4+濃度和質(zhì)外體pH計算而來[16]，在葉齡35 d時較低，于45 d達(dá)到最大值，豫煙10號、K326和NC89的升高幅度分別為128.8%、44.4%和24.7%，三者差異達(dá)到極顯著水平。隨后盡管豫煙10號有較大的下降幅度，但依然顯著高于K326和NC89。由煙草葉片氨氣揮發(fā)收集裝置測得的氨氣實際揮發(fā)量變化趨勢和上述三個指標(biāo)基本相同, 且品種間變化趨勢一致。各品種均于葉齡55 d達(dá)到最大值，與質(zhì)外體NH4+濃度變化一致，豫煙10號、K326和NC89分別為24.91、14.98和6.85 μg/(m2·h)，三個品種在葉齡 45 d 后差異均達(dá)到極顯著水平。

2.5 煙葉成熟期氮代謝酶的基因表達(dá)豐度與生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

由相關(guān)性分析 (表2) 可知，GS1的基因表達(dá)豐度與葉片總氮、葉片銨濃度、質(zhì)外體銨濃度以及氨氣揮發(fā)量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與NR活性、質(zhì)外體pH呈顯著負(fù)相關(guān)，而與GS活性和可溶性蛋白含量相關(guān)性不顯著。GS2的基因表達(dá)豐度與GS活性、總氮、可溶性蛋白含量和質(zhì)外體pH呈極顯著正相關(guān)，與NR活性、葉片銨濃度呈顯著正相關(guān)，而與質(zhì)外體銨濃度和氨氣揮發(fā)量呈顯著負(fù)相關(guān)。NR的基因表達(dá)豐度僅和NR活性呈極顯著正相關(guān)，且相關(guān)性較強，與總氮、可溶性蛋白含量、葉片銨濃度呈顯著正相關(guān)，與氨氣揮發(fā)量呈顯著負(fù)相關(guān)，與其它生理指標(biāo)沒有相關(guān)性。說明成熟期煙葉氮素運籌主要受GS同工酶基因表達(dá)豐度的影響，且可能由于GS2同工酶所占比例較高[20]，其在葉片衰老過程中的大量降解導(dǎo)致了GS總活性的下降。NR的基因表達(dá)豐度對成熟期氮效率雖有一定影響，但是作用較小，不是氮素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心。

3 討論

成熟期是烤煙葉片品質(zhì)形成的關(guān)鍵時期，氮代謝只有適時向碳代謝轉(zhuǎn)化才能形成符合工業(yè)要求的優(yōu)質(zhì)煙葉[21]。與糧食作物不同，烤煙現(xiàn)蕾打頂之后，原有的源庫關(guān)系發(fā)生改變，生長重心轉(zhuǎn)移到保留的葉片的生長發(fā)育上來[22]。葉位偏下、葉齡較大的煙葉仍然是“源”，而葉位偏上或未完全成熟的煙葉成為新的“庫”。理想的烤煙養(yǎng)分吸收模式要求成熟期具有較低的氮素同化效率。衰老葉片降解的氮素既可以轉(zhuǎn)移到其它葉片中進(jìn)行再利用，亦可以通過質(zhì)外體以氨氣的形式揮發(fā)出去[18]，不同氮效率品種這兩部分所占比重不同。近年來大量研究結(jié)果表明不同源庫器官GS同工酶的相對含量可能是造成這種差異的重要原因之一[23]。

圖 4 不同品種烤煙葉片質(zhì)外體濃度、質(zhì)外體pH、氨氣補償點和氨氣揮發(fā)量的變化動態(tài)Fig. 4 Dynamic changes of apoplastic concentration, pH, NH3 compensation point and NH3 volatilization of flue-cured tobacco leaves

表 2 煙葉成熟期氮代謝酶的基因表達(dá)豐度與生理指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of gene expression abundance in nitrogen metabolism and physiological indexes of leaves at maturing stage

GS同工酶GS1主要定位于細(xì)胞液中，其在葉片衰老時期的功能主要是降解氮素的轉(zhuǎn)移再利用[24–25]。在本研究中，各品種編碼葉片GS1同工酶的NtGS1基因在進(jìn)入衰老之后表達(dá)豐度均明顯升高。成熟期氮低效烤煙品種相對于氮高效品種而言，NtGS1基因具有較低的表達(dá)豐度，因此降解氮素向“庫”轉(zhuǎn)移的能力相對較弱，表現(xiàn)為氮低效品種葉片具有較低的總氮和可溶性蛋白等含量。這與其他作物研究結(jié)果較為一致。Brauer等[26]通過在水稻中超表達(dá)GS1基因后發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)的品系氮素收獲指數(shù)更高，GS1改變了籽粒灌漿期的氮素分配。付捷等[27]研究發(fā)現(xiàn)，氮利用高效小麥品種在籽粒形成時期具有較高的GS1基因表達(dá)豐度，可能是其具有較高氮素重新利用能力的重要原因之一。

編碼起同化作用的GS2同工酶的基因NtGS2在衰老啟動時表達(dá)量就劇烈降低。成熟期氮低效品種的NtGS2表達(dá)豐度更是低于氮高效品種，表現(xiàn)為成熟期各階段GS活性均較低，最終導(dǎo)致葉片降解的氮素再同化量較少。在植物體內(nèi)過量積累將產(chǎn)生毒害作用，而本研究中葉片濃度在葉齡45 d之后持續(xù)下降，質(zhì)外體濃度積累高峰比葉片晚10 d左右，且氨氣揮發(fā)量在成熟期大量增加，說明向質(zhì)外體轉(zhuǎn)移可能是一種緩解氨害積累的生理機制。同時成熟期氮低效品種具有相對較高的質(zhì)外體pH, 有利于形成氨氣揮發(fā)出去，從而實現(xiàn)自身的氮素調(diào)虧。氮高效品種在成熟期具有相對較高的GS1同工酶和GS2同工酶的基因表達(dá)豐度。從“源庫流”理論解釋，較高的氮素同化效率造成了氮同化物在“源”的富集，為成熟期煙株的代謝提供了豐富的底物，“源”壓力較大，同時由于其GS1基因表達(dá)豐度高，轉(zhuǎn)運效率高，衰老降解的氮素被大量再利用，向質(zhì)外體轉(zhuǎn)移量較少。源庫之間的壓力差和質(zhì)外體生理上的差異綜合導(dǎo)致了不同基因型烤煙成熟期氮素利用效率的差異。

Nit基因與硝酸還原酶活性變化趨勢相同，硝酸還原酶是植物硝酸鹽同化中的限速酶和調(diào)節(jié)酶[9]。成熟期氮低效品種具有較低的NR活性主要是由于其基因轉(zhuǎn)錄活性較低，導(dǎo)致硝酸鹽同化能力弱于氮高效品種。整體而言，NR酶活性變化趨勢在不同氮效率品種間表現(xiàn)和GS基本相似，但是和氮代謝生理指標(biāo)相關(guān)性極弱，甚至沒有相關(guān)性?？赡苡捎贜R酶活性在煙葉成熟期氮同化過程中起不到氮代謝中樞的作用，只為GS/GOGAT循環(huán)提供代謝底物，而氮代謝底物一般不構(gòu)成限制氮素利用的主要瓶頸[28]。

綜上所述，從GS同工酶的生理功能出發(fā)，推測不同烤煙品種GS同工酶的基因表達(dá)豐度差異可能導(dǎo)致成熟期氮高效品種源庫間的“源庫強差”高于氮低效品種，碳氮代謝物在源庫間轉(zhuǎn)運效率較高，更多的氮素被轉(zhuǎn)運到庫中進(jìn)行儲存。相關(guān)性分析也表明，成熟期不同氮效率烤煙品種葉片質(zhì)外體生理指標(biāo)及氨氣揮發(fā)量與GS同工酶基因表達(dá)豐度呈顯著或極顯著的相關(guān)性，說明GS同工酶基因表達(dá)豐度的差異是不同基因型間具有不同成熟期氮效率的主要原因之一。

最新研究表明，GS同工酶活性的調(diào)控在RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后修飾等不同水平上實現(xiàn)[29–30]。王小純等[31]通過對小麥GS同工酶的研究，發(fā)現(xiàn)GS同工酶上有氧化、乙?；?、磷酸化等多個翻譯后修飾作用位點，本文的研究尚未對不同成熟期氮效率品種的GS同工酶翻譯后修飾位點進(jìn)行對比。此外，某些轉(zhuǎn)錄因子也可以對GS的基因表達(dá)豐度造成影響，如TaDof1轉(zhuǎn)錄因子活性的提高可以延長生育后期小麥GS活性，從而提高小麥籽粒中蛋白質(zhì)的含量[32]。有關(guān)不同成熟期氮效率烤煙品種根系銨態(tài)氮和硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白活性的對比也尚未見報道。氮素利用效率是作物的一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，還需要其他調(diào)控的參與，如外界環(huán)境條件、激素調(diào)控等，這些都是下一步研究工作的方向和重點。

4 結(jié)論

研究了不同氮效率烤煙品種成熟期的氮代謝酶活性、基因表達(dá)以及葉片和質(zhì)外體生理指標(biāo)的差異。結(jié)果表明，氮低效烤煙品種成熟期GS同工酶和NR的基因表達(dá)豐度均較低，氮素營養(yǎng)物質(zhì)降解速度快且轉(zhuǎn)移再利用能力弱，向質(zhì)外體轉(zhuǎn)移能力強，從而以氨氣大量揮發(fā)的形式實現(xiàn)氮素調(diào)虧；而氮高效品種與其恰好相反。相關(guān)性分析表明，葉片GS酶轉(zhuǎn)錄活性最終決定了不同烤煙品種的氮素代謝能力和衰老特性。本研究對于解釋烤煙品種氮代謝差異和大田合理施肥具有一定的指導(dǎo)意義，同時對于成熟期氮低效品種的選育和新品種氮效率的預(yù)測也具有重要作用。

[1]嚴(yán)小龍, 張福鎖. 植物營養(yǎng)遺傳[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1997,78–106.Yan X L, Zhang F S. Genetics of plant nutrition[M]. Beijing: China Agriculture Press, 1997, 78–106.

[2]楊鐵釗, 林彩麗, 丁永樂, 等. 不同基因型煙草對氮素營養(yǎng)響應(yīng)的差異研究[J]. 煙草科技, 2001, (6): 32–35.Yang T Z, Lin C X, Ding Y L, et al. Study on response of different tobacco genotypes to nitrogen nutrition[J]. Tobacco Science and Technology, 2001, (6): 32–35.

[3]梁景霞, 梁康逕, 林文雄, 等. 煙草氮素營養(yǎng)的基因型差異初探[J].中國煙草學(xué)報, 2007, 13(6): 36–40.Liang J X, Liang K J, Lin W X, et al. Primary study of genotypic differences in nitrogen nutrition in tobacco germplasms[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2007, 13(6): 36–40.

[4]Purcino A A C, Lima T R, Pinto A C, et al. Glutamine synthetase response to nitrate in maize genotypes of contrasting nitrogen use efficiency[J]. Maydica, 2008, 53(2): 101–109.

[5]鄧揚悟. 甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的克隆和功能研究[D]. 上海:上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文, 2010.Deng Y W. Cloning and characterization of glutamine synthetase genes in melon[D]. Shanghai: PhD Dissertation of Shanghai Jiaotong University, 2010.

[6]Hirel B, Andrieu B, Renard S, et al. Physiology of maize II:Identification of physiological markers representative of the nitrogen status of maize (Zea mays) leaves during grain filling[J]. Physiologia Plantarum, 2005, 124(2): 178–188.

[7]Fei H, Chaillou S, Hirel B, et al. Effects of the overexpression of a soybean cytosolic glutamine synthetase gene (GS15) linked to organspecific promoters on growth and nitrogen accumulation of pea plants supplied with ammonium[J]. Plant Physiology and Biochemistry,2006, 44(10): 543–550.

[8]Li X P, Zhao X Q, He X, et al. Haplotype analysis of the genes encoding glutamine synthetase plastic isoforms and their association with nitrogen-use- and yield-related traits in bread wheat[J]. New Phytologist, 2011, 189(2): 449–458.

[9]田華, 段美洋, 王蘭. 植物硝酸還原酶功能的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2009, 25(10): 96–99.Tian H, Duan M Y, Wang L. Research progress of plant nitrate reductase function[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2009,25(10): 96–99.

[10]趙小強. 在小麥中引入和表達(dá)外源硝酸還原酶基因的研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文, 2014.Zhao X Q. Introduction and expression of exogenous nitrate reductase genes in wheat [D]. Beijing: PhD Dissertation of China Agricultural University, 2014.

[11]崔昌范, 王書凱, 宋立君. 烤煙新品種K326和NC89特征特性及配套栽培技術(shù)規(guī)范[J]. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報, 1999, (1): 70–75.Cui C F, Wang S K, Song L J. Characteristics of flue-cured tobacco new varieties K326 and NC89 and their cultivation techniques[J].Journal of Yanbian University, 1999, (1): 70–75.

[12]楊鐵釗, 張小全, 殷全玉, 等. 烤煙新品種豫煙10號的選育及特征特性[J]. 中國煙草學(xué)報, 2015, 21(3): 48–56.Yang T Z, Zhang X Q, Yin Q Y, et al. Breeding and characteristics of a new flue-cured tobacco variety Yuyan 10[J]. Acta Tabacaria Sinica,2015, 21(3): 48–56.

[13]武云杰, 李飛, 楊鐵釗,等. 氮素營養(yǎng)水平對衰老期煙葉氮代謝的影響及品種間差異[J]. 中國煙草學(xué)報, 2014, (4): 41–47.Wu Y J, Li F, Yang T Z, et al. Effects of nitrogen nutrition on nitrogen metabolism in flue-cured tobacco leaves and differences among varieties[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2014, (4): 41–47.

[14]O’Neal D, Joyk W. Glutamine synthetase of pea leaves. I.Purification, stabilization, and pH optima[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1973, 159: 113–122.

[15]鄒琦. 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000.56–129.Zou Q. The guidance of plant physiology experiment[M]. Beijing:China Agriculture Press, 2000. 56–129.

[16]段旺軍, 楊鐵釗, 劉化冰, 等. 煙葉氨氣補償點的品種間差異及其與氮素代謝的關(guān)系研究[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2011, 17(2):149–158.Duan W J, Yang T Z, Liu H B, et al. Differences in NH3compensation point among tobacco (Nicotiana tabacum L.) cultivars and its relationship with nitrogen metabolism[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2011, 17(2): 149–158.

[17]武云杰, 張小全, 段旺軍, 等. 烤煙葉片衰老期氨氣揮發(fā)特征及其生理調(diào)控研究[J]. 西北植物學(xué)報, 2012, 32(9): 2082–2088.Wu Y J, Zhang X Q, Duan W J, et al. Ammonia volatilization characteristics and its physiological regulation in flue-cured tobacco leaves during senescence[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2012, 32(9): 2082–2088.

[18]武云杰, 楊鐵釗, 張小全, 等. 不同烤煙品種煙葉衰老期氨氣揮發(fā)及其與氮素代謝的相關(guān)性[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(19):4027–4034.Wu Y J, Yang T Z, Zhang X Q, et al. Study on correlation between ammonia volatilization and nitrogen metabolism during the tobacco leaves senescence[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(19):4027–4034.

[19]Nielsen K H, Schjoerring J K. Regulation of apoplasticconcentration in leaves of oilseed rape[J]. Plant Physiology, 1998,118: 1361–1368.

[20]王小純, 安帥, 熊淑萍, 等. 小麥葉片谷氨酰胺合成酶的分離純化及鑒定[J]. 麥類作物學(xué)報, 2010, 30(1): 83–86.Wang X C, An S, Xiong S P, et al. Isolation, purification and identification of glutamine synthetase from wheat leaves[J]. Journal of Triticeae Crops, 2010, 30(1): 83–86.

[21]史宏志, 韓錦峰. 烤煙碳氮代謝幾個問題的探討[J]. 煙草科技,1998, (2): 34–36.Shi H Z, Han J F. Discussion on several problems about carbon and nitrogen metabolism in flue-cured tobacco[J]. Tobacco Science and Technology, 1998, (2): 34–36.

[22]陳永明, 鄧海濱, 楊鍵. 不同打頂方法對烤煙生長及產(chǎn)量品質(zhì)影響的研究[C]. 中國煙草學(xué)會2005年年會, 2005.Cheng Y M, Deng H B, Yang J. Study of effects on various methods of decapitation on growth, yield and quality of flue-cured tobacco[C].Chinese Tobacco Society Annual Meeting in 2005, 2005.

[23]王云華, 歐吉權(quán), 王志強, 等. 黃瓜(Cucumis sativus L.)子葉發(fā)育過程中谷氨酰胺合成酶同工酶的變化[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版),2005, 51(4): 517–520.Wang Y H, Ou J Q, Wang Z Q, et al. Changes of glutamine synthetase isozymes during the development of cucumber cotyledons[J]. Journal of Wuhan University (Science Edition), 2005,51(4): 517–520.

[24]Harrison J, Hirel B. Does lowering glutamine synthetase activity in nodules modify nitrogen metabolism and growth of lotus japonicas[J]. Plant Physiology, 2003, 133(1): 253–262.

[25]Cren M, Hirel B. Glutamine synthetase in higher plants: regulation of gene and protein expression from the organ to the cell[J]. Plant Cell Physiology, 1999, 40(12): 1187–1193.

[26]Brauer E K, Rochon A, Bi Y M, et al. Reappraisal of nitrogen use efficiency in rice overexpressing glutamine synthetase1[J].Physiologia Plantarum, 2011, 141(4): 361–372.

[27]付捷. 不同小麥品種氮效率差異及其機理初探[D]. 陜西楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2014.Fu J. Physiological and molecular mechanism of difference of nitrogen use efficiency among winter wheat genotypes[D]. Yangling,Shaanxi: MS Thesis of Northwest A&F University, 2014.

[28]Cao C L, Li S X. Effect of nitrogen level on the photosynthetic rate,NR activity and the contents of nucleic acid of wheat leaf in the stage of reproduction[J]. Chinese Bulletin of Botany, 2003, 20(3):319–324.

[29]Rueda-López M, Crespillo R, Cánovas F M, et al. Differential regulation of two glutamine synthetase genes by a single of transcription factor[J]. The Plant Journal, 2008, 56: 73–85.

[30]Stanulovi? V S, Lovillo R M G D V, Labruyère W T, et al. The 3′-UTR of the glutamine-synthetase gene interacts specifically with upstream regulatory elements, contains mRNA-instability elements and is involved in glutamine sensing[J]. Biochimie, 2006, 88(9):1255–1264.

[31]Wang X, Wei Y, Shi L, et al. New isoforms and assembly of glutamine synthetase in the leaf of wheat (Triticum aestivum L.)[J].Journal of Experimental Botany, 2015, 66(21): 6827–6834.

[32]Kumar R, Taware R, Gaur V S, et al. Influence of nitrogen on the expression of TaDof1transcription factor in wheat and its relationship with photo synthetic and ammonium assimilating efficiency[J].Molecular Biology Reports, 2009, 36(8): 2209.