黃志軍，王遙，崔國(guó)英，高藝璇，王飛，李長(zhǎng)忠( 山東省立醫(yī)院，濟(jì)南25002；2 鄒城市人民醫(yī)院)

近年來(lái)宮頸癌的發(fā)病率逐年升高并呈年輕化趨勢(shì)。人乳頭瘤病毒(HPV)感染，特別是高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌最重要的致病因素，但其并不是惟一因素。約40%處于性活躍期女性至少感染過(guò)一種類(lèi)型HPV，但僅有不到1%的女性因機(jī)體免疫系統(tǒng)無(wú)法清除HPV最終發(fā)展為宮頸癌。近年研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體免疫系統(tǒng)可能在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[1～5]。人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)是人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的編碼基因，包括經(jīng)典的HLA-Ⅰ類(lèi)分子與非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類(lèi)分子。HLA是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機(jī)體抗原呈遞和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。有研究表明，HLA完全缺失、等位基因丟失或基因特異性下調(diào)等對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要[6]。HLA-F屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類(lèi)分子，在乳腺癌、T細(xì)胞淋巴瘤等多種腫瘤組織中異常表達(dá)[8]。但鮮見(jiàn)其在宮頸癌組織表達(dá)的報(bào)道。本研究觀察了宮頸癌組織HLA-F表達(dá)變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討HLA-F在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2016年6月山東省立醫(yī)院收治的宮頸癌患者115例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸癌診斷符合《婦產(chǎn)科學(xué)》(第7版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確為宮頸鱗癌或腺癌；②采用廣泛性子宮切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)治療；③初次治療，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療；④無(wú)其他原發(fā)惡性腫瘤史或自身免疫性疾?。虎菖R床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的心、肝、腎等重要臟器疾病，以及自身免疫性疾病或其他部位惡性腫瘤者；②臨床病理資料不完整者；③術(shù)前接受過(guò)任何抗腫瘤治療者?；颊吣挲g23～75(44.53±7.65)歲，其中≤45歲 62例、>45歲 53例；組織學(xué)類(lèi)型：鱗癌87例，腺癌28例；組織分化程度：高中分化29例，低未分化86例；臨床分期(參照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2009年分期標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ期76例，Ⅱ期39例；腫瘤直徑：≥4 cm 46例，<4 cm 69例；浸潤(rùn)深度：≤1/2肌層45例，>1/2肌層70例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移85例。本研究通過(guò)山東省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬均知情同意。

1.2 宮頸癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織HLA-F表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取手術(shù)切除的宮頸癌組織115例份及其配對(duì)的癌旁正常組織20例份，多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。將切片置于烤片機(jī)上65 ℃烘烤90 min，依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗5 min×3次，PBS浸泡5 min；然后置于檸檬酸鹽修復(fù)液中，采用高壓煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫；PBS洗滌5 min×3次，37 ℃ 3% H2O2孵育30 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧物酶；PBS洗滌5 min×3次，滴加兔抗人HLA-F單克隆抗體(1：200)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；次日37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加聚合酶輔助劑，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌5 min×3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來(lái)水充分沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水，自然晾干，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以HLA-F蛋白陽(yáng)性表達(dá)的脾臟組織作為陽(yáng)性對(duì)照。由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立閱片，結(jié)果不一致時(shí)協(xié)商解決。HLA-F陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。應(yīng)用Leica IM50圖像采集系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)200倍視野，采用H-score評(píng)分法[9]半定量分析HLA-F表達(dá)。H-score評(píng)分=∑Pi(I+1)，其中Pi表示染色強(qiáng)度不同的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占該視野所有細(xì)胞總數(shù)的百分比，范圍為0～100%；I表示染色強(qiáng)度，分為4個(gè)評(píng)分等級(jí)：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。計(jì)算每張組織切片所取4個(gè)視野的H-score評(píng)分，其平均值為該切片最終的H-score評(píng)分。以H-score評(píng)分表示宮頸組織HLA-F表達(dá)。H-score評(píng)分越高，說(shuō)明宮頸組織HLA-F表達(dá)越高。

1.3 宮頸癌組織HLA-F蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)關(guān)系的分析 比較不同年齡、組織學(xué)類(lèi)型、組織分化程度等臨床病理參數(shù)的宮頸癌患者H-score評(píng)分。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織與癌旁正常組織HLA-F表達(dá)比較 宮頸癌組織HLA-F表達(dá)為(2.17±0.83)分，癌旁正常組織為(1.13±0.15)分，二者比較P<0.01。

2.2 宮頸癌組織HLA-F蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 宮頸癌組織HLA-F表達(dá)與患者組織學(xué)類(lèi)型、腫瘤直徑以及浸潤(rùn)深度有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、組織分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者通常存在免疫系統(tǒng)功能低下，機(jī)體抗腫瘤免疫監(jiān)控失靈可能在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在機(jī)體抗腫瘤免疫中占據(jù)主導(dǎo)地位的是細(xì)胞免疫，在細(xì)胞免疫中參與免疫監(jiān)視的主要效應(yīng)細(xì)胞有樹(shù)突狀細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌前病變和宮頸癌病灶中樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少、自然殺傷細(xì)胞表面的激活性受體表達(dá)降低以及輔助性T細(xì)胞亞群失衡等[10～12]。提示機(jī)體免疫系統(tǒng)功能低下可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

表1 宮頸癌組織HLA-F表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(分，

HLA-F屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類(lèi)分子，其編碼基因位于人類(lèi)6號(hào)染色體短臂上，基因全長(zhǎng)5.4 kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成。由于成熟HLA-F mRNA缺乏外顯子7，其編碼的HLA-F蛋白質(zhì)尾區(qū)短于其他HLA-Ⅰ類(lèi)分子[13]。Geraghty等[13]最早在B淋巴細(xì)胞、靜止的T細(xì)胞和皮膚癌組織內(nèi)檢測(cè)到HLA-F的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。Lee等[14]研究發(fā)現(xiàn)，盡管在膀胱、皮膚、肝臟等組織細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到HLA-F表達(dá)，但在正常機(jī)體中，大多數(shù)這類(lèi)細(xì)胞的表面無(wú)HLA-F表達(dá)。用EB病毒轉(zhuǎn)染的B細(xì)胞和單核細(xì)胞表面均可檢測(cè)到HLA-F表達(dá)，即靜止期的免疫細(xì)胞表面缺乏HLA-F表達(dá)；而一旦機(jī)體免疫細(xì)胞被激活，所有胞內(nèi)表達(dá)HLA-F的細(xì)胞均能在細(xì)胞表面表達(dá)[15]。由此推測(cè)，HLA-F可作為機(jī)體免疫激活的標(biāo)志物之一。

研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F的同源性分子HLA-E、HLA-G可參與腫瘤的免疫逃逸[8，16]。但HLA-F參與腫瘤免疫逃逸的相關(guān)研究較少。Harada等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織HLA-F陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)，但與患者生存率無(wú)關(guān)。Ishigami等[18]研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織HLA-F陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管和血管侵犯有關(guān)。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織HLA-F陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)深度以及腫瘤TNM分期均無(wú)關(guān)。Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織HLA-F陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常肝臟組織，且其表達(dá)變化與門(mén)靜脈癌栓、腫瘤數(shù)目及患者性別等有關(guān)。以上研究表明，HLA-F在腫瘤中的表達(dá)具有組織差異性，在不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著不同作用。

Lepin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F四聚體可與免疫抑制性受體ILT-2、ILT-4結(jié)合，而淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等表面均表達(dá)ILTs，故HLA-F與ILTs結(jié)合可能抑制這些免疫細(xì)胞，從而在免疫反應(yīng)的不同時(shí)期產(chǎn)生免疫耐受作用。Goodrige等[22]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F分子與HLA-Ⅰ類(lèi)分子的開(kāi)放構(gòu)象可作為配體與自然殺傷細(xì)胞及T細(xì)胞表面的KIR3DL2結(jié)合；而在炎癥反應(yīng)微環(huán)境中，KIR3DL2、HLA-F與HLA-Ⅰ表達(dá)均上調(diào)，提示三者在炎癥反應(yīng)中可能具有免疫調(diào)節(jié)作用。HLA-F在腫瘤免疫耐受機(jī)制中的作用至今尚不清楚，其在宮頸癌致病機(jī)制中的作用亦鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織HLA-F表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，與Xu等[20]的研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，HLA-F表達(dá)與宮頸癌組織學(xué)類(lèi)型、浸潤(rùn)深度、腫瘤直徑有關(guān)，而與患者年齡、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與Harada等[17]報(bào)道基本一致。上述結(jié)果表明，HLA-F與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，宮頸癌組織HLA-F表達(dá)升高，其表達(dá)變化與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。HLA-F可能通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受，從而在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mehta AM, Jordanova ES, Kenter GG, et al. Association of antigen processing machinery and HLA class I defects with clinicopathological outcome in cervical carcinoma[J]. Cancer Immunol Immunother, 2008,57(2):197-206.

[2] 薄艷秋.宮頸癌患者外周血T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞檢測(cè)的臨床意義[J].中國(guó)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2017，24(9)：50-52.

[3] 楊晶，田威，戚旻.宮頸病變患者HPV感染與淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系[J].中國(guó)婦幼保健，2017，32(19)：4827-4830.

[4] 余花艷，任統(tǒng)偉.人乳頭瘤病毒感染宮頸疾病患者外周血中MDSC、Treg、Th17細(xì)胞變化研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2017，37(8)：586-593.

[5] Reiman JM, Kmieciak M, Manjili MH, et al. Tumor immunoediting and immunosculpting pathways to cancer progression[J]. Semin Cancer Biol, 2007,17(4):275-287.

[6] Smyth MJ, Dunn GP, Schreiber RD. Cancer immunosurveillance and immunoediting: the roles of immunity in suppressing tumor development and shaping tumor immunogenicity[J]. Adv Immunol, 2006(90):1-50.

[7] 徐丹萍，林愛(ài)芬，顏衛(wèi)華.HLA-F研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2012，24(6)：578-82.

[8] Wainwright SD, Biro PA, Holmes CH. HLA-F is a predominantly empty, intracellular TAP-associated MHC class Ib protein with a restricted expression pattern[J]. J Immunol, 2000,164(1):319-328.

[9] 王遙，崔國(guó)英，王飛，等.人類(lèi)白細(xì)胞抗原-E在宮頸癌中的表達(dá)及意義[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2016，54(9)：59-63.

[10] Khaiboullina SF， Morzunov SP， Hall MR， et al. Human dendritic cells transfected with a human papilloma virus-18 construct display decreased mobility and upregulated cytokine production [J]. Int J Oncol， 2013，43(5)：1701-1709.

[11] Iijima N, Goodwin EC, Dimaio D, et al. High-risk human papillomavirus E6 inhibits monocyte differentiation to Langerhans cells[J]. Virology, 2013,444(1-2):257-262.

[12] Garcia-Iglesias T, Del Toro-Arreola A, Albarran-Somoza B, et al. Low NKp30, NKp46 and NKG2D expression and reduced cytotoxic activity on NK cells in cervical cancer and precursor lesions[J]. BMC Cancer, 2009(9):186.

[13] Geraghty DE, Wei XH, Orr HT, et al. Human leukocyte antigen F(HLA-F). An expressed HLA gene composed of a class Icoding sequence linked to a novel transcribed repetitive element[J]. J Exp Med, 1990,171(1):1-18.

[14] Lee N, Geraghty DE. HLA-F surface expression on B cell and monocyte cell lines is partially independent from tapasin and completely independent from TAP[J]. J Immunol, 2003,171(10):5264-5271.

[15] Lee N, Ishitani A, Geraghty DE. HLA-F is a surface marker on activated lymphocytes[J]. Eur J Immunol, 2010,40(8):2308-2318.

[16] Rodgers JR, Cook RG. MHC class Ib molecules bridge innate and acquired immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2005,5(6):459-471.

[17] Harada A, Ishigami S, Kijima Y, et al. Clinical implication of human leukocyte antigen (HLA)-F expression in breast cancer[J]. Pathol Int, 2015,65(11):569-574.

[18] Ishigami S, Arigami T, Setoyama T, et al. Clinical-pathological implication of human leukocyte antigen-F-positive gastric adenocarcinoma[J]. J Surg Res, 2013,184(2):802-806.

[19] Zhang JG, Zhang X, Lin A, et al. Lesion HLA-F expression is irrelevant to prognosis for patients with gastric cancer[J]. Hum Immunol, 2013,74(7):828-832.

[20] Xu Y, Han H, Zhang F, et al. Lesion human leukocyte antigen-F expression is associated with a poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Lett, 2015,9(1):300-304.

[21] Lepin EJ, Bastin JM, Allan DS, et al. Functional characterization of HLA-F and binding of HLA-F tetramers to ILT2 and ILT4 receptors[J]. Eur J Immunol, 2000,30(12):3552-3561.

[22] Goodridge JP, Burian A, Lee N, et al. HLA-F and MHC class I open conformers are ligands for NK cell Ig-like receptors[J]. J Immunol, 2013,191(7):3553-3562.