豆思遠(yuǎn),豆 玲,*,盧旺銀，徐崢嶸，李勇生

(1甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730046;2甘肅省家畜繁育中心)

牦牛巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一類多種動(dòng)物共患的一種急性、熱性傳染病,急性病例以敗血癥和出血性炎癥為主要特征。本病病原為多種條件性致病菌，一般認(rèn)為常存在于健康牛的上呼吸道和消化道粘膜上，正常情況下不引起發(fā)病，當(dāng)家畜在外界誘因諸如天氣驟變、長(zhǎng)途運(yùn)輸、衛(wèi)生條件差、營(yíng)養(yǎng)缺乏、飼料突變等不良應(yīng)激因素作用下，機(jī)體抵抗力降低時(shí)，病菌即可侵入體內(nèi)，大量繁殖，經(jīng)淋巴進(jìn)入血液，發(fā)生內(nèi)源性感染而發(fā)病。此外，也可經(jīng)呼吸道、消化道以及損傷的皮膚和粘膜感染。

甘南州牦牛生活在地域復(fù)雜、氣候惡劣的高寒缺氧地區(qū)。牦牛巴氏桿菌病在50～60年代曾廣泛流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。至80年代由于用牛出敗弱毒菌苗預(yù)防注射，本病得到有效控制。但近年來(lái)在甘南州開始陸續(xù)發(fā)生，為進(jìn)一步分析甘南牦牛巴氏桿菌病發(fā)病情況并篩選出防治甘南牦牛巴氏桿菌病的最佳藥物和治療方案，確保在最短的時(shí)間內(nèi)、以最快的速度對(duì)發(fā)病牦牛進(jìn)行治療，實(shí)現(xiàn)提高防治效果、降低死亡率的目標(biāo)，筆者進(jìn)行了研究。

1 細(xì)菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 由甘南州及所屬轄區(qū)縣區(qū)的各級(jí)動(dòng)物疫控中心，無(wú)菌采集2010～2016年間病死牦牛的淋巴結(jié)、肝、肺、脾等病料，并及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室置冰箱待檢。共采集病料共計(jì)64份。

1.1.2 試劑耗材 培養(yǎng)基基礎(chǔ)及生化鑒定管均購(gòu)自上?？畦b生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)于上海伊華科技有限公司；各類染色用染料均由甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室制備；其他試劑耗材均由甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)箱、生物安全柜、不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器、常規(guī)顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物接種試驗(yàn) 無(wú)菌環(huán)境下取病料，將其研磨成糊狀，用滅菌生理鹽水(1∶10)稀釋成乳劑，腹腔注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8只健康小白鼠，劑量為0.5 mL/只。8只小白鼠均于接種后18～24 h之間死亡，無(wú)菌采取心血以及肝病料以便做涂片鏡檢和分離培養(yǎng)。在病料采取完畢后，還對(duì)病死小白鼠尸體進(jìn)行剖檢并觀察病理變化。

1.2.2 涂片鏡檢 用致死小白鼠的心血涂片、肝病料觸片，染色、鏡檢。

美蘭染色：肝組織觸片，共8份。

瑞氏染色：心血涂片，共8份。

革蘭氏染色：共16份。

1.2.3 分離培養(yǎng) 將病料分別無(wú)菌接種在5%犢牛血清營(yíng)養(yǎng)肉湯、血液瓊脂平板和普通瓊脂平板，進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.4 生化試驗(yàn) 無(wú)菌將純培養(yǎng)待檢菌分別接種于各種糖培養(yǎng)基、鄧亨氏蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽、尿素等生化培養(yǎng)基(均由甘南州疫控中心實(shí)驗(yàn)室自制)，37℃，培養(yǎng)8～24 h。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果綜合判定及藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片擴(kuò)散法，抗菌素種類有OTC(土霉素)、AKN(丁胺卡那)、CFX(頭孢呋新)、AMP(氨芐青霉素)、TET(四環(huán)素)、STR(鏈霉素)、SMM(磺胺甲氧嘧啶鈉)CAR(羧芐青霉素)、KAN(卡那霉素)、CMP(氯霉素)、OXA(苯唑青霉素)、GEN(慶大霉素)等。將純化好的細(xì)菌用滅菌生理鹽水與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔x取1.2×109個(gè)活菌/mL濃度的菌懸液，用涂布器均勻涂布鮮血瓊脂平板，每塊平板貼3片，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果并測(cè)量抑菌圈(cm)。

1.3 結(jié)果

1.3.1 病理剖檢 在接種局部可見肌肉及皮下組織發(fā)生水腫和發(fā)炎灶；胸腔和心包有漿液性纖維素性滲出物；心外膜有較多出血點(diǎn)；淋巴結(jié)水腫增大；肝臟淤血。

1.3.2 染色鏡檢 將染色好的載玻片置于顯微鏡油鏡下觀察(用100×倍的物鏡10×倍目鏡)，美蘭和革蘭氏染色的涂片在視野中呈卵圓形或球桿菌，兩極濃染。血液涂片用瑞氏染色時(shí)，細(xì)菌被染成藍(lán)色，有少數(shù)呈淡青色。檢查結(jié)果為革蘭氏陰性球桿菌。

1.3.3 分離培養(yǎng) 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性血清肉湯培養(yǎng)24 h后輕度渾濁，連續(xù)培養(yǎng)4～6 d有菌膜產(chǎn)生，液體清澈，管底有粘稠液體；普通瓊脂平板上生長(zhǎng)貧瘠；血液瓊脂平板上形成灰白色、圓形、微隆起、半透明、濕潤(rùn)、表面光滑。邊緣整齊的露滴樣小菌落，不溶血。

1.3.4 生化試驗(yàn) 生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

注:“+”陽(yáng)性,“-”陰性。

表2 巴氏桿菌抑菌圈直徑測(cè)量結(jié)果

1.3.5 綜合判定結(jié)果 無(wú)菌采集病死牦牛病料經(jīng)涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)等結(jié)果均符合巴氏桿菌的特征，判定為分離出巴氏桿菌，綜合判定為牦牛巴氏桿菌病。

1.3.6 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，巴氏桿菌對(duì)OTC、AKN、SMM、CFX、AMP敏感；對(duì)GEN、STR、KAN、CMP中敏；對(duì)AMP、TET、OXA不敏感，結(jié)果見表2。

2 藥物治療篩選

為了確實(shí)有效地控制牦牛巴氏桿菌病的發(fā)生，最大限度減少農(nóng)牧民的經(jīng)濟(jì)損失，采取對(duì)發(fā)病牦牛及時(shí)治療，根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出有效治療藥物和方案，進(jìn)行了藥物治療篩選試驗(yàn)。

2.1 材料與方法

2.1.1 根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查情況 在牦牛巴氏桿菌病流行較為嚴(yán)重的地區(qū)作試點(diǎn)，分別在瑪曲縣的阿萬(wàn)倉(cāng)鄉(xiāng)、碌曲縣郎木寺鄉(xiāng)、卓尼縣完冒鄉(xiāng)、夏河縣阿去乎鄉(xiāng)、合作市佐蓋多瑪?shù)?個(gè)純牧業(yè)鄉(xiāng)各選擇養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖條件相當(dāng)?shù)酿B(yǎng)殖戶60戶,將這60戶5 842頭牦牛在春季高發(fā)季節(jié)發(fā)病的298頭牦牛分成4組，其中藥物試驗(yàn)3組,對(duì)照1組。試驗(yàn)組及對(duì)照組患病牦牛按年齡、病情嚴(yán)重程度均勻分組，其飼養(yǎng)條件基本相同。

2.1.2 藥物試驗(yàn)組分類 所用藥物分別是第一組土霉素注射液、第二組復(fù)方磺胺甲氧嘧啶鈉、第三組氨芐西林鈉肌注，第四組對(duì)照組配合對(duì)癥治療,主要使用抗菌消炎藥物。四個(gè)組患病牦牛在相同的飼養(yǎng)條件下，輕癥病牦牛開始只用抗菌藥物,部分癥狀加重病畜按重病治療方法治療,以抗菌消炎藥物為主。

2.1.3 試驗(yàn)由技術(shù)人員具體實(shí)施 詳細(xì)記錄治療病歷，試驗(yàn)牦牛是否發(fā)病，以出現(xiàn)牦牛巴氏桿菌病典型的臨床癥狀為依據(jù)，體溫恢復(fù)正常，精神和食欲明顯好轉(zhuǎn)，呼吸困難和各部位水腫癥狀減退，行走自如，能隨群放牧，即判定為治愈。

2.2 結(jié)果

土霉素注射液、復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉、氨芐西林鈉對(duì)牦牛巴氏桿菌病均有較好的治療作用。氨芐西林鈉對(duì)照組的藥物療效最好，治愈率達(dá)90.80%，比對(duì)照組自愈率為26.03%的效果明顯，但在實(shí)際應(yīng)用中易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)頭孢類藥物產(chǎn)生耐藥性的可選用土霉素治療。結(jié)果見表3。

表3 三種藥物對(duì)牦牛巴氏桿菌病療效比較

3 綜合防控建議

3.1 加強(qiáng)劃區(qū)輪牧管理

及時(shí)開展劃區(qū)輪牧，結(jié)合牧民的放牧生活方便性和疫病防控的需要，將放牧牦牛群劃分為“兩大四小”牧場(chǎng)輪牧。兩個(gè)大區(qū)(即夏秋、春冬牧場(chǎng))，四個(gè)小區(qū)(在兩個(gè)大區(qū)中按每年春、夏、秋、冬四季劃分)，充分利用高原紫外線殺菌、牦牛排泄物發(fā)酵殺菌等自然途徑防止本病感染發(fā)生。夏秋季節(jié)還應(yīng)注意避開過(guò)渡陰濕草場(chǎng)放牧。

3.2 消毒滅源及無(wú)害化處理

及時(shí)開展圈灘場(chǎng)地消毒工作，由于放牧牦牛群休息場(chǎng)地多為圈灘草地，且用繩索相互串聯(lián)，做好圈灘場(chǎng)地消毒工作十分重要，消毒可選用2%燒堿、10%石灰水等有效消毒藥消毒。同時(shí)對(duì)病死牦牛尸體按照“無(wú)害化處理病死牛排泄物、乳、乳制品等按照GB16548-1996《畜禽病害肉尸及其產(chǎn)品無(wú)害化處理規(guī)程》”進(jìn)行無(wú)害化處理。

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