王道平 徐 江 牟永瑩, 閆文秀, 趙夢潔 馬 博 李 群 張麗娜, 潘映紅,,*

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表油菜素內(nèi)酯影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

王道平1,2徐 江2牟永瑩2,3閆文秀2,3趙夢潔3馬 博3李 群1,*張麗娜2,3潘映紅2,3,*

1新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 新疆烏魯木齊 830046;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;3農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程, 北京 100081

表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epibrassinolide, EBR)是一種被廣泛研究和應(yīng)用的油菜素內(nèi)酯類(brassinosteroids, BRs)植物生長調(diào)節(jié)劑, 它能有效增強(qiáng)植物對低溫的耐受性, 但EBR在蛋白質(zhì)組水平上對水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫的影響尚不清楚。本研究用0.1 mg L–1EBR和蒸餾水分別浸泡萌發(fā)的日本晴種子, 然后提取4°C脅迫培養(yǎng)和26°C正常培養(yǎng)幼苗的總蛋白, 進(jìn)行質(zhì)譜非標(biāo)(label-free)定量分析和平行反應(yīng)監(jiān)測(parallel reaction monitoring, PRM)驗(yàn)證。最終共鑒定出5778個蛋白質(zhì), 其中, 在有定量信息的4834個蛋白中, 401個上調(diào)和220個下調(diào)蛋白與EBR影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫有關(guān)。功能分析和代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn), 上調(diào)蛋白主要與RNA結(jié)合或水解酶活性等分子功能相關(guān), 并富集在碳代謝、葉酸合成和氨基酸生物合成等途徑中; 下調(diào)蛋白主要與催化活性和氧化還原酶活性相關(guān), 主要涉及卟啉和葉綠素代謝等代謝途徑。PRM驗(yàn)證結(jié)果和文獻(xiàn)證據(jù)顯示, 分布在碳代謝和苯丙素代謝通路中的NADP-蘋果酸酶、過氧化物酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和丙酮酸激酶參與了EBR對低溫脅迫水稻幼苗的調(diào)控, 提示BRs可通過多種途徑影響水稻幼苗對低溫脅迫的響應(yīng)。

表油菜素內(nèi)酯; 低溫脅迫; 蛋白質(zhì)組學(xué); 水稻

作為植物內(nèi)源信號的乙烯、生長素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉素、油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids, BRs)等激素在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。其中BRs是一類在體內(nèi)分布廣泛但不長距離運(yùn)輸?shù)溺摅w激素, 這類激素全面參與植物的細(xì)胞擴(kuò)增、分化、生長發(fā)育、衰老以及光形態(tài)建成等生物過程[3-5], 對植物響應(yīng)高溫、低溫、干旱和鹽脅迫均有調(diào)控作用[5-6]。有研究用BRs類植物生長調(diào)節(jié)劑表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epibrassinolide, EBR)處理擬南芥和歐洲油菜的幼苗, 增強(qiáng)了植物對干旱和低溫脅迫的耐受性[7]; BRs生物合成基因在種子中過表達(dá)也可提高擬南芥幼苗的耐冷性[8]。在苦瓜中發(fā)現(xiàn)BRs可以通過增加植物鮮重、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量以及增強(qiáng)超氧化物歧化酶(SOD)活性等來降低低溫脅迫對苦瓜生長的影響[9]。對玉米的研究發(fā)現(xiàn), EBR處理幼苗可增加株高, 提高葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量, 并顯著增強(qiáng)植株的低溫耐受性[10]。番茄葉面噴施EBR后, 可緩解低溫對光合作用和氮代謝的影響, 提高低溫弱光脅迫下番茄的鮮重和干重[11]。此外, BRs還可以通過增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)和維持光系統(tǒng)II來緩解辣椒中由低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化脅迫[12]。這些研究均表明BRs可以增強(qiáng)植物的低溫抗性, 但有關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究尚不多見。從現(xiàn)有的BRs影響植物低溫脅迫蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果來看, 綠豆中的上調(diào)蛋白質(zhì)主要參與甲硫氨酸的同化、ATP合成、細(xì)胞壁構(gòu)建和應(yīng)激反應(yīng)[13]; 辣椒的差異蛋白主要參與催化及活性調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性分子活性、能量轉(zhuǎn)運(yùn)過程和蛋白質(zhì)結(jié)合等生物過程及光合固碳途徑、氧化磷酸化途徑、谷胱甘肽代謝途徑、苯丙素生物合成途徑、苯丙氨酸代謝途徑和核糖體途徑等[12]。上述結(jié)果提示, BRs可能通過調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的豐度來影響植物對低溫脅迫的響應(yīng)。

水稻是一種被廣泛研究的重要作物, 與水稻相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究主要集中在響應(yīng)鹽脅迫、干旱脅迫等方面, 有關(guān)低溫脅迫的研究相對較少。對1周齡水稻幼苗進(jìn)行低溫處理后發(fā)現(xiàn), 膜結(jié)構(gòu)受損, 代謝變化劇烈, 水稻防御系統(tǒng)在低溫脅迫下被激活[14]。2周齡幼苗低溫脅迫6 h后, 一些蛋白質(zhì)包括應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)和負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)等出現(xiàn)上調(diào)[15]; 低溫脅迫12 h后, 根部組織的烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、核苷二磷酸激酶、抗壞血酸過氧化物酶等的蛋白豐度可增加2倍以上[16]; 低溫脅迫24 h后葉片的差異蛋白主要包括蛋白質(zhì)生物合成因子、分子伴侶、細(xì)胞壁組分生物合成酶、抗氧化/解毒酶以及與能量代謝通路相關(guān)的蛋白質(zhì), 這些蛋白主要定位于葉綠體中[17]; 幼苗經(jīng)48 h低溫脅迫, 能量代謝和應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)明顯上調(diào), 而防御相關(guān)蛋白質(zhì)下調(diào)[18]。進(jìn)一步對水稻幼苗12~14°C處理48 h、72 h和96 h的研究發(fā)現(xiàn), 差異蛋白質(zhì)主要是物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、光合作用、前體代謝產(chǎn)物和能量代謝相關(guān)類蛋白, 組蛋白和維生素B生物合成相關(guān)蛋白的豐度明顯受到冷脅迫的影響[19]。這些蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果說明水稻幼苗受不同程度低溫脅迫處理后, 光合作用、能量代謝和應(yīng)激相關(guān)蛋白會出現(xiàn)明顯的變化, 但是目前仍然不清楚BRs如何在蛋白質(zhì)水平上影響水稻幼苗對低溫脅迫的響應(yīng)。

本研究采用表油菜素內(nèi)酯(EBR)處理萌發(fā)的水稻種子, 利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和分析可能與EBR影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫有關(guān)的蛋白, 旨在為進(jìn)一步研究BRs影響植物響應(yīng)低溫脅迫機(jī)制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

日本晴種子在16 h光照(26°C)/8 h黑暗(22°C)條件下萌發(fā)培養(yǎng)7 d后, 用0.1 mg L–1EBR浸泡12 h, 對照為蒸餾水浸泡, 浸泡后的萌發(fā)種子分別在16 h光照/8 h黑暗的4°C和26°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取芽, EBR處理4°C培養(yǎng)樣品, 單獨(dú)4°C培養(yǎng)樣品, EBR處理26°C培養(yǎng)樣品和單獨(dú)26°C培養(yǎng)樣品分別標(biāo)記為4B、4、26B和26,-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 葉綠素測定方法

取每個樣品新鮮芽0.2 g,-80°C冷凍1 h, 加入10 mL80%丙酮溶液, 50°C水浴3 h至葉片發(fā)白。以80%丙酮為空白, 分別測定葉綠素提取液在663 nm和645 nm波長的光密度, 按下列公式計(jì)算葉綠素和含量(D645和D663表示在645 nm和663 nm波長下的光密度, V為定容體積10 mL, W為稱樣量0.2 g)。

葉綠素(mg g–1) = (12.72D663-2.69D645) V/(W1000)

葉綠素(mg g–1) = (22.88D645-4.68D663) V/(W1000)

1.3 蛋白提取及酶切

稱取0.2 g樣品用細(xì)胞破碎儀20 Hz s–1振蕩破碎, 加入0.4 mL提取緩沖液(8mol L–1Urea, 2 mmol L–1EDTA, 20 mmol L–1CaCl2, 200 mmol L–1NaCl, 100 mmol L–1Tris-HCl, pH 8.1), 13 000′離心30 min; 轉(zhuǎn)移上清液到10 K超濾管內(nèi)超濾離心(13 000′, 30 min, 下同), 棄濾出液, 加入200 μL現(xiàn)配的積二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)溶液(50 mmol L–1DTT, 8 mol L–1Urea, 100 mmol L–1Tris-HCl, pH 8.1), 30°C孵育60 min; 超濾離心除去濾出液, 分3次加入200 μL尿素緩沖液(8mol L–1Urea, 100mmol L–1Tris-HCl, pH 8.1)洗滌超濾, 加入100 μL現(xiàn)配碘乙酰胺(iodoacetamide, IAA)溶液(50 mmol L–1IAA, 8 mol L–1Urea, 100 mmol L–1Tris-HCl, pH 8.1)暗置30 min; 超濾離心除去濾出液, 用100 μL尿素緩沖液(8mol L–1Urea, H2O)洗滌超濾3次, 加入200 μL NH4HCO3溶液(50 mmol L–1)洗滌超濾2次; 加入50 μL蛋白酶解液(含0.5 μg Trypsin, 50 mmol L–1NH4HCO3), 同時更換超濾管外管, 37°C酶切10 h, 超濾離心得到質(zhì)譜分析樣品。

1.4 質(zhì)譜分析

液相色譜分離在Easy nLC 1000納升級液相色譜儀(Thermo Fisher公司產(chǎn)品)上完成。流動相A為0.1%甲酸水(Formic Acid, FA), 雙蒸水; 流動相B: 0.1% FA, CAN。設(shè)置流動相的梯度為流速0.4 mL min–1, 3%~6% 3 min, 6%~22% 78 min, 22%~100% 1 min, 100% 8 min。質(zhì)譜分析在依靠靜電場軌道離子阱(Orbitrap)檢測離子質(zhì)量的Q Exactive Plus (QE Plus, Thermo Fisher公司產(chǎn)品)質(zhì)譜儀上完成, 采集模式為數(shù)據(jù)依賴型(data dependent acquisition, DDA)。設(shè)一級質(zhì)譜的分辨率為70 000, 掃描范圍為300~1800 m/z, 自動增益控制值為3e6, 注入時間為50 ms。二級質(zhì)譜的分辨率為17 500, 自動增益控制值1e5, 注入時間45 ms, 碰撞能量27 NCE。二級采集的標(biāo)準(zhǔn)以前20個最強(qiáng)離子為母離子, 再進(jìn)行Orbitrap檢測。每個樣品進(jìn)行3次質(zhì)譜技術(shù)重復(fù)。

1.5 蛋白質(zhì)鑒定及數(shù)據(jù)庫搜索

利用Proteome Discoverer 2.0定性分析軟件(Thermo Fisher公司產(chǎn)品), 對質(zhì)譜的原始數(shù)據(jù)RAW文件進(jìn)行定性分析。檢索引擎設(shè)定為SEQUEST HT, 檢索數(shù)據(jù)庫為植物基因組中水稻數(shù)據(jù)庫(https:// phytozome.jgi.doe.gov/, 版本為Osativa_323_v7.0. protein)。設(shè)定如下定性搜庫參數(shù), 即肽段置信度為高, 最多蛋白漏切位點(diǎn)數(shù)2個, 肽段的長度范圍6~144個氨基酸, 母離子質(zhì)量偏差為±10 μmol L–1, 碎片離子質(zhì)量偏差0.02 Da, 固定修飾選擇半胱氨酸(Cys)碘乙酰胺化(carbamidomethy/+57.021 Da), 可變修飾選擇甲硫氨酸(Met)氧化(oxidation/+15.995 Da)和N-乙?；?Acetyl/+42.011 Da), 肽段搜庫假陽性率FDR為1%。將每個樣品3次重復(fù)的數(shù)據(jù)一起檢索, 得到每個樣品的定性結(jié)果, 分別以Excel表格的形式輸出。

采用Maxquant軟件(http://www.coxdocs.org/, 版本為1.3.0.5) 定量分析, 檢索數(shù)據(jù)庫同上。用全部樣品(各自重復(fù)3次)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)一起進(jìn)行非標(biāo)定量(label-free)分析, 設(shè)定如下參數(shù), 即胰蛋白酶為默認(rèn)的蛋白酶, 2個漏切位點(diǎn), 固定修飾選擇半胱氨酸碘乙酰胺化, 可變修飾選擇甲硫氨酸氧化和N-乙?；? 先驅(qū)離子質(zhì)量偏差為±20 μmol L–1, 碎片離子質(zhì)量偏差0.02 Da, 能夠檢測到的肽段長度的最小值是7個氨基酸, 肽段搜庫假陽性率FDR為1%。4個樣品的相對定量結(jié)果以Excel表格的形式輸出, 供后續(xù)比較分析。

1.6 數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

使用SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件(https://www.ibm. com/analytics)對各樣品定量數(shù)據(jù)進(jìn)行皮爾遜(Pearson)相關(guān)性分析。通過絕對值的大小表示樣品間線性相關(guān)強(qiáng)弱的程度, 絕對值越大表示相關(guān)性越高, 如果樣品間相關(guān)系數(shù)的絕對值為0則表示無關(guān), 在0.9以上為高度相關(guān), 1表示變量完全正相關(guān)。

1.7 生物信息學(xué)分析

用于生物信息分析的定量蛋白質(zhì)假陽性率q-value值<0.01, 4個樣品的總信號強(qiáng)度Intensity>0, 蛋白質(zhì)信號強(qiáng)度的相對比值大于或等于2倍即視為差異蛋白質(zhì)。從植物基因組水稻數(shù)據(jù)庫中分別批量提取上調(diào)和下調(diào)差異蛋白質(zhì)的FASTA格式序列導(dǎo)入Omicsbean軟件(http://www.omicsbean.cn/)進(jìn)行本體(Gene Ontology, GO)和代謝通路(Kyoto Encyclo-pedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析。

1.8 PRM靶向定量

4個樣品混合樣的上樣量為1mL, DDA分析和定性搜庫參數(shù)設(shè)置同上。將混合樣中待驗(yàn)證蛋白的定性結(jié)果導(dǎo)入Skyline軟件(https://skyline.ms/), 選擇待驗(yàn)證目標(biāo)蛋白肽段并編輯PRM檢測方法, 使用QE-Plus分別采集4個樣品中待驗(yàn)證蛋白的PRM定量數(shù)據(jù), 離子隔離窗口(isolation window)為1.6 m z–1, 一級全掃描1次結(jié)合30次PRM掃描, 一級全掃描的分辨率為70 000, PRM掃描分辨率設(shè)為17 500, 用Skyline完成待驗(yàn)證蛋白的定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻低溫脅迫表型觀察及葉綠素含量測定

EBR處理26°C常溫培養(yǎng)的樣品與單獨(dú)26°C培養(yǎng)樣品在表型上無差異, 低溫培養(yǎng)的兩組樣品中, 單獨(dú)4°C培養(yǎng)樣品明顯偏黃, 芽也相對細(xì)弱(圖1-A)。常溫培養(yǎng)樣品的葉綠素和葉綠素的含量均沒有顯著差異, 但明顯高于低溫培養(yǎng)的樣品; EBR處理4°C培養(yǎng)樣品與單獨(dú)4°C培養(yǎng)樣品相比, 葉綠素含量差異顯著, 葉綠素含量差異不顯著(圖1-B); 全株稱重3次, 每次10粒發(fā)芽種子, 結(jié)果顯示4個樣品間的全株鮮重?zé)o顯著差異(圖1-C)。

圖1 水稻低溫脅迫表型及葉綠素含量

A: 4組樣品表型圖; B: 4組樣品葉綠素和葉綠素含量比較; C: 4組樣品全株重比較。隨機(jī)選取10株幼苗稱重, 重復(fù)3次, 算其平均值作為該組樣品的全株鮮重。4B: EBR處理4°C培養(yǎng)樣品, 4: 單獨(dú)4°C培養(yǎng)樣品, 26B: EBR處理26°C培養(yǎng)樣品, 26: 單獨(dú)26°C培養(yǎng)樣品。B和C中標(biāo)以不同小字母的同組數(shù)值在0.05水平差異顯著。

A: four groups of sample phenotype; B: comparison of chlorophylland chlorophyllcontents in four groups of samples; C: comparison of whole plant weight in four groups of samples, randomly selected 10 seedlings and weighed which was repeated three times and calculate the average value as the whole plant fresh weight of a group. 4B: samples treated with EBR then cultured at 4°C, 4: samples cultured at 4°C, 26B: samples treated with EBR then cultured at 26°C, 26: samples cultured at 26°C. Values within a group followed by a different small letter are significantly different at the 0.05 probability level in B and C.

2.2 質(zhì)譜分析

從4個樣品定性鑒定到5778個蛋白質(zhì), 平均鑒定到每個樣品4331個蛋白質(zhì), 低溫脅迫樣品與正常培養(yǎng)樣品(4 vs 26, 4B vs 26B)相比鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)量較少, 但同溫度培養(yǎng)的EBR處理樣品蛋白鑒定數(shù)有所增加。2個樣品間共有的蛋白質(zhì)數(shù)在3508到3631之間, 其中正常培養(yǎng)的2個樣品的共有蛋白質(zhì)數(shù)量最多, 占2個樣品總蛋白數(shù)的72.4%; 低溫脅迫處理的2個樣品間共有蛋白質(zhì)數(shù)量最少, 僅占2個樣品總蛋白數(shù)的69.3%; 4個樣品共有蛋白數(shù)為3112, 占4個樣品總蛋白數(shù)的53.9% (圖2-A)。對質(zhì)譜定量數(shù)據(jù)的Pearson相關(guān)分析表明, 樣品4B與其他幾組樣品的相似度普遍較高, 樣品4B和26的定量結(jié)果相似度最高, 樣品4B和26B以及不加EBR處理的兩組樣品的相似度居中, 樣品4和26B的相似度低于其他的組合(圖2-B)。4組樣品定量鑒定結(jié)果還顯示, EBR處理后正常培養(yǎng)及低溫脅迫的樣品中檢測到有定量信息的蛋白質(zhì)均增加, 且蛋白質(zhì)信號強(qiáng)度多為107~108(圖2-C)。

A:定性鑒定蛋白數(shù)及樣品間共有蛋白數(shù); B: 樣品間的皮爾遜相關(guān)性分析圖; C: 定量鑒定蛋白質(zhì)信號強(qiáng)度分布表。

A: qualitatively identified proteins and common proteins between samples; B: Pearson correlation analysis between samples; C: signal intensity distribution of quantitative identified proteins.

2.3 定量蛋白差異特性分析

利用DDA質(zhì)譜數(shù)據(jù), 采用非標(biāo)定量方法共鑒定到4834個有可靠定量信息的蛋白質(zhì), 其中樣品4和26 (4 vs 26), 樣品4B和26B (4B vs 26B), 樣品4B和4 (4B vs 4), 以及樣品26B和26 (26B vs 26)兩兩相比豐度差異大于2倍的上、下調(diào)蛋白數(shù)見圖3-A。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn), 在“4B vs 26B”和“4B vs 4”上調(diào)蛋白的并集(4BH∪B4H)中, 即EBR處理4°C培養(yǎng)樣品分別與EBR處理26°C培養(yǎng)及無EBR處理4°C培養(yǎng)樣品相比上調(diào)的1429個蛋白中, 與“26B vs 26”和“4 vs 26”下調(diào)蛋白有交集的有401個, 記為與EBR影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫有關(guān)的上調(diào)蛋白(圖3-B); “4B vs 26B”和“4B vs 4”下調(diào)蛋白的并集(4BL∪B4L)有1293個, 其中與“26B vs 26”和“4 vs 26”上調(diào)蛋白共有的有220個, 記為與EBR影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫有關(guān)的下調(diào)蛋白(圖3-C)。

2.4 GO分析

在與EBR影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫有關(guān)差異蛋白中, 上調(diào)蛋白質(zhì)的分子功能主要涉及RNA結(jié)合、小分子結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、氧化還原酶活性和輔酶結(jié)合等, 多數(shù)蛋白位于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和有膜細(xì)胞器等, 參與了小分子代謝、有機(jī)氮化合物代謝、羧酸代謝、含氧酸代謝、有機(jī)酸代謝、碳水化合物生物合成、生物合成及基因表達(dá)等生物學(xué)過程(圖4-A); 下調(diào)蛋白質(zhì)其分子功能主要涉及輔因子結(jié)合、催化活性、輔酶結(jié)合、水解酶活性等, 多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)膜系統(tǒng), 生物過程富集分析顯示這些蛋白主要參與了氧化還原、分解、含氧酸代謝、有機(jī)氮化合物代謝和小分子代謝等過程(圖4-B)。

圖3 定量蛋白的差異性比較

A: 樣品間的差異蛋白數(shù); B:與EBR影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫有關(guān)上調(diào)蛋白維恩圖; C: 與EBR影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫有關(guān)下調(diào)蛋白維恩圖。H表示上調(diào), L表示下調(diào)。

A: proteins with intensity difference between every two samples; B: Venn diagram shows the 401 up-regulated proteins related to the effect of EBR on rice seedings response to cold stress; C: Venn diagram shows the 220 down-regulated proteins related to the effect of EBR on rice seeding response to cold stress. H means up regulated and L means down regulated.

圖4 影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫相關(guān)蛋白的本體分析

A: 401個上調(diào)蛋白質(zhì)的本體分析; B: 220個下調(diào)蛋白質(zhì)的本體分析。

A: gene ontology analysis of 401 up-regulated proteins; B: gene ontology analysis of 220 down-regulated proteins.

2.5 代謝途徑分析

對差異蛋白進(jìn)行代謝通路富集分析, 發(fā)現(xiàn)在<0.05的范圍內(nèi), 上調(diào)蛋白與葉酸生物合成、嘧啶代謝、氨基酸的生物合成、剪接體、碳代謝等代謝途徑相關(guān)(圖5-A)。下調(diào)蛋白與卟啉和葉綠素代謝、核黃素代謝、檸檬烯和蒎烯降解、其他代謝途徑等相關(guān)(圖5-B)。

在KEGG富集分析中,值低于0.16且富集蛋白數(shù)多于4的重要代謝通路及其富集到的蛋白質(zhì)種類見表1。

如表1所示, 富集在碳代謝途徑中的NADP依賴性蘋果酸酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶(LOC_Os11g10980.1), 苯丙素的生物合成途徑中的過氧化物酶(LOC_Os01g73200.1)等僅在樣品4B中被檢測到。碳代謝途徑中的烯醇化酶、卟啉和葉綠素代謝途徑中的聯(lián)乙烯還原酶(divinyl reductase, DVR)在樣品4B中的蛋白豐度是樣品4和26B中的2倍以上。

圖5 代謝通路分析

A: 401個上調(diào)差異蛋白質(zhì)代謝通路分析; B: 220個下調(diào)差異蛋白質(zhì)的代謝通路分析。

A: KEGG pathways analysis of 401 up-regulated proteins; B: KEGG pathways analysis of 220 down-regulated proteins.

表1 與EBR影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫相關(guān)的重要通路及富集的蛋白質(zhì)

Table 1 Important pathways and enriched proteins related to the effect of EBR on rice seedings response to cold stress

通路和蛋白Pathway name and protein IDs注解Annotation信號強(qiáng)度Intensity 2626B44B 碳代謝 Carbon metabolism LOC_Os01g54030.1Nadp-dependent malic enzyme0.00E+000.00E+000.00E+001.78E+07 LOC_Os02g38200.1Dehydrogenase3.97E+081.78E+089.81E+072.64E+08 LOC_Os03g15050.2Phosphoenolpyruvate carboxykinase1.22E+085.70E+074.21E+071.26E+08 LOC_Os04g24140.1Ribose-5-phosphate isomerase a1.10E+088.97E+061.79E+077.07E+07 LOC_Os06g04510.1Enolase5.68E+071.08E+070.00E+002.00E+07 LOC_Os06g05700.1Cysteine synthase0.00E+000.00E+000.00E+008.73E+06 LOC_Os06g45590.1Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase0.00E+000.00E+000.00E+003.28E+07 LOC_Os07g09890.1Hexokinase2.82E+070.00E+000.00E+002.09E+07 LOC_Os08g02700.1Fructose-bisphospate aldolase isozyme3.73E+070.00E+000.00E+008.83E+06 LOC_Os09g24910.2Phosphofructokinase0.00E+000.00E+000.00E+002.38E+07 LOC_Os11g10980.1Pyruvate kinase0.00E+000.00E+000.00E+001.06E+07 LOC_Os11g41160.3Phosphoserine phosphatase2.13E+071.00E+070.00E+002.83E+07 LOC_Os12g05110.1Pyruvate kinase2.37E+081.29E+085.51E+072.95E+08 LOC_Os06g35540.1Aminotransferase5.93E+071.63E+081.61E+087.89E+07 LOC_Os06g44460.1D-3-phosphoglycerate dehydrogenase9.76E+067.49E+072.85E+073.37E+07 LOC_Os05g49760.1Dehydrogenase0.00E+001.20E+081.00E+083.93E+07 苯丙素生物合成 Phenylpropanoid biosynthesis LOC_Os10g17650.1Os10bglu34—beta-glucosidase homologue1.02E+080.00E+007.90E+074.76E+08 LOC_Os01g32364.1Os1bglu1—beta-mannosidase/glucosidase homologue0.00E+000.00E+000.00E+008.51E+06 LOC_Os01g73200.1Peroxidase0.00E+000.00E+000.00E+002.12E+07 LOC_Os02g41680.1Phenylalanine ammonia-lyase7.94E+060.00E+000.00E+006.33E+06 LOC_Os04g56180.1Peroxidase1.25E+082.86E+075.14E+077.05E+07 LOC_Os03g11420.1Os3bglu6—beta-glucosidase/beta-fucosidase/beta-galactosidase0.00E+002.25E+073.03E+076.87E+06 LOC_Os01g22249.1Peroxidase1.24E+075.91E+072.05E+080.00E+00 LOC_Os05g04500.1Peroxidase8.07E+061.92E+085.61E+070.00E+00 LOC_Os07g01410.1Peroxidase2.01E+075.70E+068.45E+070.00E+00 LOC_Os08g34280.1Cinnamoyl-coa reductase0.00E+006.70E+066.25E+070.00E+00 LOC_Os09g33680.1Os9bglu31—beta-glucosidase, dhurrinase0.00E+004.08E+071.92E+071.48E+07 卟啉和葉綠素代謝 Porphyrin and chlorophyll metabolism LOC_Os03g22780.1DVR8.72E+070.00E+004.27E+079.48E+07 LOC_Os01g16520.1Glutamyl-tRNA synthetase0.00E+001.59E+071.40E+070.00E+00 LOC_Os01g57460.1Frataxin, putative, expressed4.04E+079.91E+071.15E+080.00E+00 LOC_Os10g37210.1FAD dependent oxidoreductase domain containing Protein2.01E+073.51E+065.45E+070.00E+00 LOC_Os04g41260.1Amine oxidase0.00E+002.87E+061.70E+070.00E+00 葉酸生物合成 Folate biosynthesis LOC_Os11g29390.1Bifunctional dihydrofolate reductase-thymidylate synthase4.47E+061.31E+073.66E+060.00E+00 LOC_Os09g38759.1Dihydroneopterin aldolase2.42E+070.00E+005.66E+062.25E+07 LOC_Os04g38950.1Class I glutamine amidotransferase6.99E+070.00E+002.89E+072.37E+07 LOC_Os03g02030.2Folylpolyglutamate synthase0.00E+000.00E+000.00E+002.04E+07 LOC_Os02g35200.1Vp150.00E+000.00E+000.00E+007.22E+06

(續(xù)表1)

通路和蛋白Pathway name and protein IDs注解Annotation信號強(qiáng)度Intensity 2626B44B 不飽和脂肪酸生物合成 Biosynthesis of unsaturated fatty acids LOC_Os01g65830.1Acyl-desaturase6.12E+070.00E+000.00E+008.06E+06 LOC_Os02g48560.6Fatty acid desaturase4.69E+087.57E+078.14E+073.83E+08 LOC_Os08g10010.1Acyl-desaturase1.38E+082.72E+074.92E+076.52E+07 LOC_Os11g39220.2Acyl-coenzyme A oxidase0.00E+004.07E+073.18E+070.00E+00 脂肪酸生物合成 Fatty acid biosynthesis LOC_Os01g65830.1Acyl-desaturase6.12E+070.00E+000.00E+008.06E+06 LOC_Os08g10010.1Acyl-desaturase1.38E+082.72E+074.92E+076.52E+07 LOC_Os03g28420.13-oxoacyl-synthase8.02E+073.53E+070.00E+001.01E+08 LOC_Os01g48910.2Long-chain acyl-coa synthetase3.27E+072.61E+074.38E+065.34E+07 LOC_Os12g04990.3Long-chain acyl-coa synthetase1.80E+072.67E+076.15E+079.72E+06

2.6 PRM驗(yàn)證

PRM技術(shù)可對樣品中的目標(biāo)肽段進(jìn)行準(zhǔn)確的特異性分析, 因此可用于驗(yàn)證非標(biāo)記定量分析得到的差異蛋白。在對所有差異蛋白的生物學(xué)功能分析的基礎(chǔ)上, 選取NADP-蘋果酸酶(LOC_Os01g540 30.1)、過氧化物酶(LOC_Os01g73200.1)、3-磷酸甘油酸脫氫酶(LOC_Os06g44460.1)、烯醇化酶(LOC_ Os06g04510.1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(LOC_Os06g 45590.1)和丙酮酸激酶(LOC_Os11g10980.1)共6個蛋白進(jìn)行PRM分析(圖6)。表明EBR影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫相關(guān)的1個下調(diào)和5個上調(diào)蛋白在4個樣品中的變化趨勢與DDA數(shù)據(jù)(表1)基本一致。

3 討論

以往的研究證實(shí), 低溫脅迫可影響光合作用、細(xì)胞膜、活性氧累積等相關(guān)生物學(xué)過程[20], 而激素在植物對低溫脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[21]。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了EBR影響水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫的相關(guān)蛋白和代謝通路, 為進(jìn)一步的相關(guān)機(jī)制研究提供了新的線索。

圖6 部分差異豐度蛋白PRM 驗(yàn)證