艾麗娟 陳 強 楊春燕 閆 龍 王鳳敏 葛榮朝張孟臣,*

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大豆籽粒硬實加性和上位性QTL定位

艾麗娟1,2,**陳 強2,**楊春燕2閆 龍2王鳳敏2葛榮朝1,*張孟臣2,*

1河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北石家莊 050024;2河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所/ 國家大豆改良中心石家莊分中心/ 農(nóng)業(yè)部黃淮海大豆生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/ 河北省遺傳育種重點實驗室, 河北石家莊 050035

硬實是植物種子的普遍特性, 是影響大豆種子發(fā)芽率、生存能力及儲存期的重要數(shù)量性狀, 同時影響著大豆的加工品質(zhì)。本實驗通過對大豆籽粒硬實性狀的加性和上位性互作QTL (quantitative trait locus)分析, 明確控制大豆籽粒硬實的重要位點及效應(yīng), 旨在為進一步解析硬實性狀復(fù)雜的遺傳機制提供理論依據(jù)。以冀豆12和地方品種黑豆(ZDD03651)雜交構(gòu)建的包含186個家系的F6:8和F6:9重組自交系群體為材料, 采用WinQTL Cartographer V. 2.5的復(fù)合區(qū)間作圖法(composite interval mapping, CIM)定位不同年份的籽粒硬實性狀相關(guān)的加性QTL, 同時采用IciMapping 4.1軟件中的完備區(qū)間作圖法(inclusive composite interval mapping, ICIM)檢測籽粒硬實性狀的加性及上位性QTL。共檢測到3個籽粒硬實性狀相關(guān)的加性QTL, 分別位于第2、第6和第14染色體, 遺傳貢獻率范圍為5.54%~12.94%。同時檢測到4對上位性互作QTL, 分別位于第2、第6、第9、第12和第14染色體, 可解釋的表型變異率為2.53%~3.47%。同時檢測到籽粒硬實性狀加性及上位性互作QTL, 且上位性互作多發(fā)生在主效QTL間或主效QTL與非主效QTL間, 表明上位性互作效應(yīng)在大豆籽粒硬實性狀的遺傳基礎(chǔ)中具有重要的作用。

大豆; 硬實; QTL; 上位性互作

硬實是種子休眠類型之一, 普遍存在于豆科作物中[1]。硬實主要是由于種皮的不滲透性吸水導(dǎo)致, 而種皮迅速均勻的滲透性吸水是許多豆科作物馴化的關(guān)鍵特征之一[2-5]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中, 硬實嚴重影響種子的發(fā)芽率和出苗率[6-7]; 在大豆食品加工過程中, 硬實對大豆食品的感觀品質(zhì)及碾磨品質(zhì)產(chǎn)生影響[8-9]; 在品種改良中, 硬實嚴重阻礙種質(zhì)資源的利用。硬實對種子的休眠萌發(fā)和延長種子壽命起著重要作用, 因此有利于種質(zhì)保存[1]; 硬實也被認為是野生物種長期生存所需的重要特性[10-11]。此外, 硬實種子與種皮中的鈣含量相關(guān)[12-13], 可以潛在增強大豆食品的營養(yǎng)價值。目前, 關(guān)于種子硬實遺傳控制的信息較少, 因此有必要對大豆籽粒硬實特性的遺傳機制進一步解析。硬實特性是受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀[1], 通過QTL (quantitative trait locus)定位分析, 檢測與種子硬實相關(guān)的QTL, 對解析硬實形成相關(guān)分子機制及分子標記輔助選擇(marker-assisted selection, MAS)育種具有重要的指導(dǎo)意義。

前人利用經(jīng)典遺傳學(xué)方法研究硬實性狀, 發(fā)現(xiàn)大豆籽粒硬實性狀受少數(shù)基因控制, 但在顯隱性關(guān)系和基因數(shù)目上具有爭議[14-16]。近年來, 隨著分子標記技術(shù)的快速發(fā)展, 國內(nèi)外學(xué)者對大豆籽粒硬實性狀QTL定位分析發(fā)現(xiàn), 籽粒硬實QTL主要分布在第2、第3、第6、第8、第10、第19和第20等[9,17-18]連鎖群上。Sun等[19]在第2染色體上定位到控制野生大豆籽粒種皮滲透性的QTL (), 通過精細定位及基因功能分析發(fā)現(xiàn), 在編碼鈣調(diào)磷酸跨膜蛋白與種皮鈣含量有關(guān)的基因上的點突變導(dǎo)致了硬實, 而在該基因附近, Jang等[20]通過精細定位、基因表達和測序分析發(fā)現(xiàn),同樣可導(dǎo)致籽粒硬實, 它編碼內(nèi)切- 1,4-b-葡聚糖酶可在柵欄細胞的外層上產(chǎn)生1,4-b-葡聚糖衍生物使得種皮更硬, 導(dǎo)致大豆種皮不滲透性吸水從而產(chǎn)生硬實。隨著研究的深入, QTL間的上位性互作逐漸受到重視, 前人相繼研究證明上位性效應(yīng)在復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳中起著重要的作用[21]。上位性效應(yīng)的機制分析和作用效果對于品種改良至關(guān)重要, 2017年Soyk等[22]在番茄研究中發(fā)現(xiàn), 負向的上位性效應(yīng)會阻礙優(yōu)勢性狀的表現(xiàn), 該研究利用基因編輯手段控制負向上位性效應(yīng), 從而培育出高產(chǎn)番茄品種。與進化和自然選擇相比, 強烈的人工選擇可能會推動更頻繁的上位性發(fā)生, 上位性效應(yīng)普遍存在。前人研究大豆籽粒硬實性狀多分析加性效應(yīng)影響, 雖已有籽粒硬實相關(guān)基因報道, 對上位性效應(yīng)檢測研究涉及較少, 僅Liu等[23]通過雙因素方差分析檢測到位于第2和第6染色體上的籽粒硬實QTL間存在上位性互作效應(yīng), 但上位效應(yīng)值尚不明確, 因此解析QTL之間的上位性互作并估算其效應(yīng), 明確現(xiàn)有QTL間的上位性互作關(guān)系及效應(yīng), 發(fā)掘上位性互作QTL新位點可為進一步解析大豆籽粒硬實遺傳基礎(chǔ)及輔助育種提供依據(jù)。

本研究利用高世代重組自交系群體及WinQTL Cartographer V. 2.5和IciMapping 4.1軟件對不同年份的大豆籽粒硬實性狀進行加性檢測。并使用IciMapping 4.1軟件對籽粒硬實性狀進行上位性QTL分析, 探明加性和上位性互作效應(yīng)對籽粒硬實性狀的影響, 為QTL的精細定位及基因克隆奠定基礎(chǔ), 為分子標記輔助育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以育成品種冀豆12和農(nóng)家種黑豆(ZDD03651)雜交通過單粒傳法構(gòu)建的包含186個家系的F6:8和F6:9重組自交系為材料。其中冀豆12是河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所育成的百粒重為22 g的大粒品種, 黑豆(ZDD03651)為百粒重7 g的小粒農(nóng)家種。將該群體F6:8(2011年)和F6:9(2013年)重組自交系及其親本播種于石家莊田間, 采用3 m行長, 3行區(qū), 隨機區(qū)組實驗設(shè)計, 行距0.5 m, 株距0.1 m。分別從自然成熟的親本和重組自交系群體每個株系隨機收獲10株, 研究其籽粒。

1.2 實驗方法

分別從親本和重組自交系每個株系中隨機選取60粒正常籽粒, 設(shè)每份材料3個重復(fù), 將20粒籽粒浸泡在盛有20 mL蒸餾水的培養(yǎng)皿中, 于室溫下浸泡7 d。每天統(tǒng)計籽粒硬實數(shù), 硬實率=Y/20× 100%, 其中Y為籽粒硬實數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件完成籽粒硬實性狀的均值、偏度、峰度及正態(tài)分布檢驗等分析。

1.4 QTL定位

本研究所用分子遺傳連鎖圖譜由本實驗室前人[24-25]構(gòu)建完成, 包含SSR標記154個, 總長度為1516.1 cM, 標記間的平均遺傳距離為9.3 cM。采用Windows QTL Cartographer 2.5軟件中的復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)檢測不同年份下大豆籽粒硬實性狀相關(guān)的主效QTL; 以IciMapping 4.1軟件中的完備區(qū)間作圖法(ICIM)進行籽粒硬實性狀的加性及上位性QTL定位分析。顯著主效QTL的LOD閾值為2.5, 顯著上位性QTL的LOD閾值為5.0。采取McCouch等[26]的方式命名QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒硬實測定的種子浸泡時間

浸泡1 d后群體籽粒大部分表現(xiàn)為非硬實狀態(tài), 隨著浸泡天數(shù)的增加, 硬實率的變化差異不顯著(<0.05)。不同年份的RIL (recombinant inbred lines)群體籽粒硬實率平均值隨浸泡天數(shù)的變化略有差異, 但總體趨勢基本一致(圖1)。因此以浸泡1 d后群體的籽粒硬實率進行后續(xù)分析及QTL定位。

圖1 籽粒硬實率變化情況

2.2 表型數(shù)據(jù)分析

由表1可知, 浸泡1 d后, 親本冀豆12的硬實率為0, 黑豆的硬實率在71.65%~83.33%左右, 兩親本間籽粒硬實率存在明顯差異, 為QTL定位分析提供了較好的遺傳背景。RIL群體各家系籽粒硬實率的分離程度較大, 變異范圍為0~96.67%, 變異系數(shù)介于56%~75%之間, 且RIL群體的籽粒硬實性狀存在超高親分離。由其頻率分布圖可知籽粒硬實性狀的表型值呈連續(xù)性變異(圖2)。

表1 不同環(huán)境下大豆親本及RIL群體的籽粒硬實率的表型值

圖2 大豆籽粒硬實性狀頻率分布圖

2.3 籽粒硬實加性QTL分析

由表2可知, 兩年中共檢測到3個籽粒硬實性狀相關(guān)的加性QTL, 分別位于第2 (D1b)、第6 (C2)和第14 (B2)染色體, 可解釋的表型變異率在5.54%~ 12.94%之間。其中位于第2染色體的Sat_069– Sat_183標記之間的和位于第6染色體的Sat_402–Satt460標記之間的用兩種方法均能被檢測到, 且和在CIM法中兩年環(huán)境下均能被檢測到, 為穩(wěn)定的QTL位點, 貢獻率最大, 分別為6.82%和12.94%, 加性效應(yīng)最大, 分別為5.16和7.92, 增效基因來自黑豆。用兩種方法均僅在2013年檢測到, 貢獻率分別為8.25%和9.39%, 加性效應(yīng)分別為-6.26和-7.47, 位于第14染色體的Satt577–Sat_287標記之間, 其增效基因來源于冀豆12。

表2 用不同方法檢測到的不同環(huán)境下大豆籽粒硬實加性QTL

2.4 籽粒硬實上位性QTL分析

對于兩年環(huán)境下的大豆籽粒硬實性狀共檢測到4對上位性互作QTL (表3和圖3)。上位性效應(yīng)值在-10.08~11.64之間, 貢獻率在2.53%~3.47%之間。其中第6染色體上的和第2染色體上的、第9染色體上的以及第12染色體上的均存在上位性互作。和之間的互作僅在2011年中被檢測到, 貢獻率為2.69%, 上位性效應(yīng)為8.66, 為親本型大于重組型互作。和以及間的互作在兩年中均能被檢測到, 貢獻率最大, 分別為3.36%和3.47%, 上位性效應(yīng)最大, 分別為11.64和-8.15。另外, 第14染色體上和第12染色體上的也存在上位性互作, 僅在2013年被檢測到, 貢獻率為3.13%, 上位性效應(yīng)為10.10, 表現(xiàn)為親本型大于重組型。

表3 不同環(huán)境下大豆籽粒硬實性狀的上位性效應(yīng)

3 討論

3.1 與前人QTL定位結(jié)果的比較

本研究檢測到籽粒硬實性狀相關(guān)的加性QTL 3個, 分別位于第2、第6和第14染色體。與QTL和與前人所報道標記區(qū)間相同或相近, 這兩個位點在前人研究中多次被檢測到, 且在本研究中的不同年份間穩(wěn)定表達, 表明和為籽粒硬實的穩(wěn)定主效QTL。Liu等[23]研究中檢測到第2染色體上的硬實相關(guān)QTL位于標記Satt456附近, 與本研究得到的位點的標記區(qū)間(Sat_096–Sat_183)區(qū)域相近, 且Jang等[20]和Sun等[19]分別在該區(qū)域附近發(fā)現(xiàn)與大豆種皮滲透性相關(guān)的基因, 分別為和。本研究所檢測到的位于第6染色體的Sat_402–Satt460標記區(qū)間, 與Watanabe等[17]檢測到的籽粒硬實QTL區(qū)間Satt489–Satt100部分重疊。本研究所檢測到的位于第14染色體的Satt577–Sat_287標記區(qū)間, 前人研究中均沒檢測到該位點, 因只在一年中檢測到, 該位點是否為新位點需進行進一步的研究。此外, Keim等[18]和Watanabe等[17]在第3、第8、第19和第20染色體上也檢測到籽粒硬實相關(guān)的加性QTL, 而在本研究與Liu等[23]研究中均沒檢測到, 可能是由于定位群體遺傳背景或環(huán)境差異造成。

QTL間的上位性互作是數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的重要組成部分, 上位性互作對解析復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)具有十分重要的意義[27-30]。本研究檢測到4對籽粒硬實性狀相關(guān)的上位性互作QTL, 其中位于第6染色體上的分別與第2染色體上的, 第9染色體上的及第12染色體上的間均存在上位性互作。與間的互作發(fā)生在加性QTL間, Liu等[23]同樣檢測到位于第2和第6染色體上控制籽粒硬實性狀相關(guān)的加性QTL間發(fā)生互作。與及間的互作發(fā)生在加性效應(yīng)QTL與非加性效應(yīng)QTL之間, 且在不同年份間均被檢測到。另外,還與存在上位性互作。說明除加性QTL起作用外, QTL之間的上位性互作也是影響性狀的重要因素。

圖3 檢測到的加性QTL及上位性互作QTL在連鎖群上的分布

黑色區(qū)段為QTL所在區(qū)域, 虛線代表上位性互作QTL位點。

The black bars show the support interval of QTL position, the dotted line represents epistatic QTLs.

3.2 籽粒硬實上位性互作的遺傳機制

在遺傳學(xué)領(lǐng)域, 上位性效應(yīng)(epistasis)是指某基因的表達受到另一非等位基因的作用, 這種非等位基因間的抑制或遮掩作用叫上位效應(yīng)。在不同的生物體中各種各樣的上位相互作用的分子機制被研究發(fā)現(xiàn)[31]。最近Cho等[32]研究表明, 控制大豆種皮色的位點和位點間的互作主要是由于位點的功能基因編碼Argonaute類蛋白, 該蛋白可以結(jié)合到小RNA上, 進而通過剪切mRNA、抑制翻譯、促進DNA甲基化等各種形式實現(xiàn)RNAi干擾的效果, 影響了小RNA的分布從而調(diào)節(jié)位點的基因的表達, 最終控制大豆種皮顏色的調(diào)控過程。因此, 小RNA在QTL間的上位性互作中起著非常重要的作用。另外QTL間的上位性互作可能與基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān), 即QTL間主要是通過基因間的正向誘導(dǎo)表達或負向反饋抑制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)上位性互作[33]。本研究檢測到4對上位性互作QTL, 其中第2染色體上的和第6染色體上的間存在上位性互作, 且第2染色體上已報道了2個與大豆種皮滲透性相關(guān)的基因, 分別為和。若上位性互作QTL的遺傳機制可能與上述遺傳機制相一致, 即與和兩個基因的表達有關(guān)。因此可以這2個已報道的基因為出發(fā)點, 尋找與其表達過程中相關(guān)的酶或調(diào)控因子, 進而確定第6染色體上QTL位點區(qū)域內(nèi)與其互作的基因位點。同樣另外3對上位性互作位點也可通過以上方法進一步研究, 從而確定互作的基因。因此我們可以將基因的表達及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為解析籽粒硬實遺傳機制的突破口, 研究這4對互作QTL之間的遺傳機制, 探究籽粒硬實形成機制, 挖掘出與籽粒硬實相關(guān)的基因。

4 結(jié)論

首次報道了籽粒硬實相關(guān)的4對上位性互作QTL。確定了加性效應(yīng)及QTL間的上位性互作效應(yīng)在大豆籽粒硬實性狀的遺傳基礎(chǔ)中均具有重要的作用。因此, 在大豆籽粒硬實性狀分子標記輔助育種中, 既要考慮具有加性效應(yīng)的QTL, 也要考慮具有上位性互作的QTL。

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Mapping Main-effect and Epistatic QTL for Hard Seededness in Soybean

AI Li-Juan1,2,**, CHEN Qiang2,**, YANG Chun-Yan2, YAN Long2, WANG Feng-Min2, GE Rong-Chao1,*, and ZHANG Meng-Chen2,*

1College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, Hebei, China;2Institute of Cereal and Oil Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Shijiazhuang Branch of National Soybean Improvement Center / Huang-Huai-Hai Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Soybean, Ministry of Agriculture / Hebei Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Shijiazhuang 050035, Hebei, China

Hardness is a common characteristic of plant seeds, which is an important quantitative trait affecting germination rate, viability and storage life, and also processing quality of soybean seeds. In this study QTL analysis of the additive and epistatic interaction was used to reveal the important loci and effects controlling soybean hard seededness, and to provide theoretical basis for further analysis of the complex genetic mechanism of hard seededness. F6:8and F6:9populations of 186 recombinant inbred lines (RIL) derived from a cross of Jidou 12 and native variety Heidou (ZDD03651) were used to determine the additive QTLs for hard seededness in different years by the composite interval mapping (CIM) method in WinQTL Cartographer V. 2.5 software. The inclusive complete interval mapping (ICIM) method in IciMapping 4.1 software was used for analysing the interaction of additive and epistatic QTLs for hard seededness. Three QTLs for hard seededness were identified on Chr. 02, Chr. 06, and Chr. 14, respectively, with the genetic contribution rate of 5.54%–12.94%. Four pairs of epistatic interaction QTLs were detected on Chr. 02, Chr. 06, Chr. 09, Chr. 12, and Chr. 14, respectively, with explained 2.53%–3.47% of the phenotypic variation. The QTLs of additive and epistatic interactions were also detected in the hard seeds of soybean, and the epistasis was performed between the main effect QTLs or between the main effect QTL and the non-main effect QTL. The results indecate that the epistatic interaction effect plays an important role in the genetic basis of hard seededness of soybean.

soybean; hard seededness; QTL; epistasis

): 2017-09-05;

2018-01-08;

2018-01-23.

10.3724/SP.J.1006.2018.00852

張孟臣, E-mail: mengchenzhang@hotmail.com; 葛榮朝, E-mail: grcgp@sina.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

艾麗娟, E-mail: ailijuanalj@163.com; 陳強, E-mail: chenqiangwsm@163.com

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0100201), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-004-PS06)和河北省重點研發(fā)計劃(16227516D)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0100201), the China Agriculture Research System (CARS-004-PS06), and Key Research and Development Projects of Hebei Provence (16227516D).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180122.1429.032.html