王鳳芹 楊媛媛 陳楚昊 胡喻涵 路則慶 汪以真

(浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，浙江省飼料與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058)

20世紀(jì)50年代以來(lái)，為了促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高動(dòng)物的健康水平，大量的獸藥被用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。然而，這些藥物在食品生產(chǎn)性動(dòng)物中的濫用和過度使用會(huì)導(dǎo)致其在肉、蛋和奶等產(chǎn)品中殘留[1-5]。為了確保人畜安全，自2006年開始，歐盟全面禁止在食品生產(chǎn)性動(dòng)物中使用抗生素作為促生長(zhǎng)飼料添加劑[6]。然而，抗生素仍然有可能被非法添加到飼料中。因此，監(jiān)測(cè)飼料中的抗生素殘留對(duì)于保障動(dòng)物源性食品安全具有重要意義，監(jiān)測(cè)飼料中的藥物含量也就成為確保飼料和食品安全的重要手段[7]。

沃尼妙林與泰妙菌素(圖1)屬同一類藥物，是新一代截短側(cè)耳素類半合成抗生素[8-9]，屬于雙烯萜類，因其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及支原體有特效而被廣泛使用在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及飼料添加劑中。

目前，針對(duì)沃尼妙林和泰妙菌素這2種物質(zhì)含量的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[10-12]和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)法[13-16]。歐盟非強(qiáng)制執(zhí)行法案(2002/657/EC)引入了質(zhì)譜分析方法鑒定點(diǎn)數(shù)(identification point,IP)的概念。作為用于確定動(dòng)物來(lái)源樣品的確認(rèn)方法，建議抗生素檢測(cè)應(yīng)基于不止一個(gè)特征。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下，產(chǎn)生1個(gè)母離子和2個(gè)子離子，可提供4個(gè)IP，可用于抗生素的定量檢測(cè)。而HPLC耦合二極管陣列檢測(cè)器只能產(chǎn)生1個(gè)IP[6]。因此，對(duì)于沃尼妙林和泰妙菌素這2種物質(zhì)的定量檢測(cè)多采用LC-MS/MS法。目前，對(duì)沃尼妙林和泰妙菌素含量檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道大多針對(duì)畜禽肉制品、水產(chǎn)品、牛奶、蜂蜜等動(dòng)物源性食品[15,17-22]，而以飼料為分析對(duì)象的相關(guān)研究還比較少。

圖1 沃尼妙林(a)和泰妙菌素(b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of valnemulin (a) and tiamulin (b)

從飼料的成分來(lái)講，它可能包括谷類食品、糖類或水果、脂肪、根或塊莖、豆科或油脂植物、氨基酸和礦物質(zhì)等。因此，飼料基質(zhì)本身是一種極為復(fù)雜的樣品，在檢測(cè)抗生素的過程中，主要干擾物有碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)、維生素、無(wú)機(jī)物、添加劑以及污染物和殘留物等。這些物質(zhì)有可能被一起提取出來(lái)，導(dǎo)致在LC-MS/MS法檢測(cè)沃尼妙林和泰妙菌素含量過程中的信號(hào)抑制[6,23]，只有有效地提取和凈化才能保證抗生素含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

鑒于此，本試驗(yàn)針對(duì)配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混合飼料這3種飼料樣本，對(duì)儀器條件及前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，擬成功建立一種快速有效監(jiān)測(cè)飼料中沃尼妙林和泰妙菌素含量的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-UPLC-MS/MS)法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑

鹽酸沃尼妙林(純度≥99.95%)購(gòu)自加拿大Toronto公司。泰妙菌素(純度≥98%)和色譜級(jí)甲酸(純度≥98%)購(gòu)自美國(guó)Aladdin公司。色譜級(jí)甲醇和乙腈購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。MCX固相萃取柱(60 mg，3CC)購(gòu)自美國(guó)Waters Oasis公司。氨水為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。飼料樣品由浙江科盛飼料股份有限公司提供。

1.1.2 主要儀器

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters ACQUITYTMUPLC TQ Mass detector，美國(guó)Waters公司)、KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、超純水儀(德國(guó)EMD Millipore公司)、電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)、ST 40R離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)、氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)。

1.2 樣品的預(yù)處理

1.2.1 提取

稱取2.0 g的飼料樣品于50 mL離心管中，加入15 mL甲醇[24]，置于超聲波清洗器中超聲振蕩30 min，將上述提取液離心10 min，轉(zhuǎn)速設(shè)為5 000 r/min，收集上清液，并向沉淀中加入15 mL甲醇，再次超聲振蕩30 min，按上述方法離心，離心結(jié)束后合并2次上清液，加入0.2%甲酸水溶液，用容量瓶定容至50 mL備用。

1.2.2 凈化

從容量瓶中移取1 mL提取液，上MCX固相萃取柱，依次用2 mL 60%甲醇水溶液(含0.1%甲酸)、2 mL 5%甲酸水溶液、2 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱，棄去淋洗液。然后用2 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，50 ℃水浴，氮?dú)獯蹈蒣24]。加入2 mL 20%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)，過0.22 μm濾膜，待超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析。

1.3 UPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：BEH C18，50 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.5 mL/min[25]；流動(dòng)相A相：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B相：0.1%甲酸乙腈溶液，色譜分離梯度洗脫條件如表1所示。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子源溫度：150 ℃；霧化溫度：500 ℃；霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣為高純氮?dú)?，碰撞氣為高純氬氣?/p>

按照歐盟規(guī)定(2002/657/EC)，在質(zhì)譜條件中，本試驗(yàn)每種物質(zhì)選擇了1個(gè)母離子，2個(gè)子離子。質(zhì)譜分析條件如表2所示。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取13.31 mg鹽酸沃尼妙林標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈溶解并定容于25 mL容量瓶中，配制成沃尼妙林濃度為500.0 μg/mL的儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱取12.50 mg泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈溶解并定容于25 mL容量瓶中，配制成泰妙菌素濃度為500.0 μg/mL的儲(chǔ)備液；吸取等體積的沃尼妙林和泰妙菌素儲(chǔ)備液混合配成沃尼妙林和泰妙菌素濃度均為250.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

表2 質(zhì)譜分析條件

將沃尼妙林和泰妙菌素濃度均為250.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成7個(gè)濃度梯度(0.25、1.25、2.50、12.50、25.00、62.50和125.00 μg/mL)，稱取7份空白飼料樣品各2.0 g，取上述7個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液各4 mL，依次添加到7份2.0 g的空白飼料中，并按照1.2中方法對(duì)7份空白飼料進(jìn)行處理，得到濃度依次為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00和5.00 μg/mL的沃尼妙林和泰妙菌素飼料基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行，每個(gè)平行樣進(jìn)2針。另外稱取6份空白配合飼料樣品，除不添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作液外，其他處理同上，作為空白基質(zhì)。將上述樣品過0.22 μm濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.5 方法的準(zhǔn)確度與精密度

考慮到飼料中沃尼妙林和泰妙菌素的臨床添加濃度在5～200 μg/g，以及過高的檢測(cè)濃度可能對(duì)液質(zhì)聯(lián)用儀造成污染等情況，本試驗(yàn)分別取1.25、12.50以及62.50 μg/mL 3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到飼料基質(zhì)中，得到最終計(jì)算濃度為2.5、25.0以及125.0 mg/kg的3個(gè)藥物添加水平。每種飼料在每個(gè)濃度下設(shè)6個(gè)平行，每個(gè)平行樣進(jìn)2針，計(jì)算回收率及變異系數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理和計(jì)算，結(jié)果以平均值來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍

按照1.4的步驟進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，在濃度為0.01～5.00 μg/mL范圍內(nèi)，沃尼妙林的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=315.8x-21 855.8，相關(guān)系數(shù)(R2)=0.998 8；泰妙菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=552.9x+59 124.5，R2=0.996 1。

2.2 方法的檢測(cè)限與定量限

本試驗(yàn)中選定沃尼妙林的檢測(cè)限為25.0 ng/g，泰妙菌素的檢測(cè)限為5.0 ng/g，檢測(cè)限均大于3倍信噪比；沃尼妙林和泰妙菌素的定量限均為0.5 μg/g，定量限大于10倍信噪比，滿足國(guó)際分析方法性能的要求。

2.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度

本方法以配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料為研究對(duì)象，稱取2.0 g飼料，分別加入沃尼妙林和泰妙菌素濃度為1.25、12.50以及62.50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液4 mL，按照“1.2”的操作方法制備樣品溶液，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)6次，結(jié)果見表3。在添加水平為2.5～125.0 mg/kg范圍內(nèi)，沃尼妙林的回收率為85.17%～94.55%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.56%～7.65%，泰妙菌素的回收率為84.69%～99.36%，RSD為1.57%～4.95%。并且，由空白飼料色譜圖(圖2)可以看出，空白飼料完全沒有沃尼妙林和泰妙菌素，在基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖3)中可以看出，峰形尖銳且沒有雜峰干擾，表明該測(cè)定方法穩(wěn)定，能滿足國(guó)內(nèi)外獸藥殘留檢測(cè)分析方法性能的要求。

MRM：多反應(yīng)監(jiān)測(cè) multiple reaction monitoring；4 Channels：4個(gè)通道；ES+:電噴霧離子源正離子模式 electrospray ionization in positive ion mode；Valnemulin：沃尼妙林；Tiamulin：泰妙菌素。下圖同 The same as below。

圖2空白飼料色譜圖

Fig.2 Chromatograms of blank feed

圖3 基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 μg/mL)色譜圖Fig.3 Chromatograms of matrix with standard solution (0.05 μg/mL)表3 飼料樣品中的沃尼妙林和泰妙菌素回收率Table 3 Recoveries of valnemulin and tiamulin in feed samples (n=6) %

3 討 論

3.1 樣品基質(zhì)效應(yīng)

樣品的基質(zhì)會(huì)對(duì)藥物產(chǎn)生抑制或增強(qiáng)作用[24]，本試驗(yàn)檢測(cè)上機(jī)濃度為0.05 μg/mL的混合標(biāo)樣與飼料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，統(tǒng)計(jì)2種標(biāo)準(zhǔn)溶液中沃尼妙林的子離子263.02和泰妙菌素的子離子192.01的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)：沃尼妙林標(biāo)準(zhǔn)品的子離子263.02平均峰面積為12 353，而飼料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的子離子263.02平均峰面積為11 680；泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)品的子離子192.01的平均峰面積為51 487，而飼料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的子離子192.01平均峰面積為44 116。由于基質(zhì)的影響面積均有下降，表明飼料基質(zhì)對(duì)沃尼妙林和泰妙菌素均產(chǎn)生了抑制效應(yīng)，所以本試驗(yàn)采用了空白飼料樣品添加沃尼妙林和泰妙菌素的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)校正。

3.2 固相萃取柱的選擇

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)固相萃取柱凈化的樣品會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)[26]，造成色譜柱污染，峰形變寬、柱壓升高以及靈敏度下降等一系列問題。在這種情況下，本試驗(yàn)在參考文獻(xiàn)[10-11]的基礎(chǔ)上，嘗試了3種規(guī)格的MCX固相萃取柱3CC(60 mg)、6CC(150 mg)和6CC(500 mg)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種6CC規(guī)格的固相萃取柱需要更多的洗脫液，而樣品經(jīng)3CC(60 mg)規(guī)格的固相萃取柱凈化后可完全消除基質(zhì)效應(yīng)，并且得到可靠的試驗(yàn)結(jié)果。因此，從效率和經(jīng)濟(jì)的角度考慮，本試驗(yàn)最終選擇了3CC(60 mg)這個(gè)規(guī)格的MCX固相萃取柱用于飼料樣品的凈化。

3.3 凈化條件的選擇

Oasis MCX填料是一種混合型陽(yáng)離子交換反相吸附劑，對(duì)堿性化合物具有很高的選擇性和靈敏度。它提供了離子交換和反相雙重保留模式。在凈化程序上，對(duì)于Oasis MCX固相萃取柱的應(yīng)用，一般文獻(xiàn)會(huì)先依次用甲醇、水和甲酸水溶液對(duì)其進(jìn)行預(yù)活化[10,14]，再進(jìn)行上樣。本研究經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不需要經(jīng)過預(yù)活化，直接對(duì)Oasis MCX固相萃取柱進(jìn)行上樣，隨即再進(jìn)行洗脫，完全可以消除基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)得到較高的回收率。

3.4 氮吹儀水浴溫度的選擇

參考文獻(xiàn)中對(duì)于含沃尼妙林和泰妙菌素的提取液或洗脫液的濃縮多采用氮吹儀，而水浴溫度設(shè)置有37[25]、40[27]和50 ℃[24]3個(gè)溫度，本試驗(yàn)對(duì)沃尼妙林和泰妙菌素濃度為0.10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液采用上述3個(gè)溫度進(jìn)行了氮?dú)鉂饪s再稀釋測(cè)定，與不經(jīng)過濃縮直接配制的0.10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液相比，發(fā)現(xiàn)不同的水浴溫度對(duì)于沃尼妙林和泰妙菌素并沒有影響，結(jié)果如表4所示。因此，為了提高試驗(yàn)效率，本試驗(yàn)選定水浴溫度為50 ℃。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)依次用2 mL 60%甲醇水溶液(含0.1%甲酸)、2 mL 5%甲酸水溶液、2 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱，然后用2 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，可得到獲得凈化的含沃尼妙林和泰妙菌素的提取液，成功建立了固相萃取凈化程序。

表4 不同水浴溫度下沃尼妙林和泰妙菌素的回收率

② 本試驗(yàn)通過外標(biāo)法校正基質(zhì)干擾，通過UPLC-MS/MS分析，建立了定量測(cè)定飼料中沃尼妙林和泰妙菌素的方法。該方法中沃尼妙林和泰妙菌素的檢測(cè)限分別為25.0和5.0 ng/g。

③ 沃尼妙林和泰妙菌素濃度在0.01～5.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2均大于0.99。在3個(gè)濃度(2.5、25.0、125.0 mg/kg)下進(jìn)行添加試驗(yàn)，沃尼妙林的回收率為85.17%～94.55%，RSD為2.56%～7.65%，泰妙菌素的回收率為84.69%～99.36%，RSD為1.57%～4.95%。

④ 綜上，本試驗(yàn)建立的SPE-UPLC-MS/MS法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，可應(yīng)用于飼料中沃尼妙林和泰妙菌素的快速定量分析。

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