楊天任 王 帥 黃 爍 尚麗君 于海濤 曾祥芳 譙仕彥*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，生物飼料添加劑北京市重點實驗室，北京 100193； 2.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070)

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是生物進化上最古老的抗微生物感染多肽，是從原核生物到人類等各種生物先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，構成宿主防御病原微生物入侵的第1道屏障[1-2]?？咕木哂袕V譜抗菌活性，因其不易產(chǎn)生耐藥性而成為抗生素替代品研究的熱點[3-4]。近年來的研究表明，抗菌肽除了具有直接抑菌活性外，還具有調節(jié)炎癥反應、趨化免疫細胞、促進細胞分化、激活先天性和獲得性免疫反應等多種免疫調節(jié)功能，并與機體抵抗病原微生物感染以及免疫疾病密切相關[2,5]。有研究顯示，抗菌肽可以提高動物對抗原特異性體液免疫和細胞免疫的應答水平，增加疫苗免疫效果[6-8]，展示了其在人類及動物健康、疾病防治方面的廣闊應用前景。Sublancin是美國馬里蘭大學Hansen研究團隊從枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定到一種抗菌肽，是由37個氨基酸以及2個二硫鍵組成的陽離子肽，其氨基酸序列為GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVACQNYRQFCR，分子質量約為3 875.74 u[9-10]。Sublancin的性質極其穩(wěn)定，可耐受1.5～9.5的pH，可在高溫環(huán)境中穩(wěn)定存在，能夠抑制革蘭氏陽性菌的出芽生長和繁殖分裂[11]。本實驗室的前期研究表明，免疫調節(jié)是Sublancin抵抗金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、魏氏梭菌感染小鼠和肉雞的重要功能，且劑量為1.0和2.0 mg/kg的Sublancin在小鼠試驗中均有顯著的作用效果[12]。我國農(nóng)業(yè)部批準使用的免疫調節(jié)劑有黃芪多糖、羊胎盤轉移因子和紫錐菊3種，其中黃芪多糖目前使用最為廣泛[13]，因此，本試驗以黃芪多糖為對照物，比較研究抗菌肽Sublancin和黃芪多糖對小鼠免疫功能的調節(jié)效果，為抗菌肽Sublancin作為免疫增強劑在動物生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及試驗動物

4～6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司。本試驗在農(nóng)業(yè)部飼料效價和安全評價監(jiān)督檢驗測試中心(北京)鼠營養(yǎng)代謝室進行。采用電腦控制鼠房溫度、濕度和光照，鼠房溫度為18～22 ℃，相對濕度為35%～55%，晝夜光照交替時間為12 h∶12 h。小鼠自由采食和飲水。小鼠飼糧為商品飼糧，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 試驗設計

將60只4～6周齡健康雌性BALB/c小鼠隨機分成6組，每組10只。各組小鼠先連續(xù)灌胃7 d、每天1次、每只0.2 mL的下列物質：空白對照組，灌胃生理鹽水；攻毒組，灌胃生理鹽水；12.0 mg/kg BW黃芪多糖組，灌胃12.0 mg/kg BW的黃芪多糖溶液；48.0 mg/kg BW 黃芪多糖組，灌胃48.0 mg/kg BW的黃芪多糖溶液；1.0 mg/kg BW Sublancin組，灌胃1.0 mg/kg BW的Sublancin溶液；2.0 mg/kg BW Sublancin組，灌胃2.0 mg/kg BW的Sublancin溶液。除空白對照組外，其余5組在灌胃結束24 h后均灌胃濃度為1×109CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌進行攻毒，每只200 μL。分別在攻毒3和24 h后從每組隨機選取5只小鼠進行樣品采集。

1.3 樣品采集

將每組隨機選取的5只小鼠進行眼眶采血，每只收集200～300 μL血樣至1.5 mL無菌離心管中；室溫靜置2 h后，將血樣在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min；之后在無菌條件下，用移液槍吸出上層淡黃色血清并分裝，貯存于-80 ℃冰箱中待測。采血完成后，將小鼠脫臼處死，無菌取脾臟，制備切片；無菌條件下，取部分盲腸內容物。

1.4 檢測指標

1.4.1 血清中細胞因子含量

首先參考Luminex平臺ProcartaPlex多因子分析技術中方法進行磁珠混合液、清洗緩沖液、質控品和標準品的制備以及血清樣本的稀釋。然后在96孔芯片相應孔中分別加入25 μL空白品、標準品、質控品和稀釋的待測血清樣本(1∶400)，再向每孔加入25 μL磁珠混合液，封膜置于平板搖床上4 ℃避光孵育過夜。清洗芯片3次，以去除多余的血清中未結合成分，然后每孔加入50 μL檢測抗體，室溫(20～25 ℃)避光振搖1 h，再次清洗后，向每孔加入50 μL鏈霉素偶聯(lián)的藻紅蛋白(PE)熒光染料，室溫避光振搖30 min。最后，清洗芯片3次，加入100 μL鞘液，室溫避光振蕩10 min重懸磁珠。采用Magpix儀器檢測血清中白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-25(IL-25)、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的含量。

1.4.3 腸道內容物中沙門氏菌的數(shù)量

取攻毒后3和24 h小鼠的盲腸內容物各0.1 g，分別于900 μL生理鹽水中溶解，并分別稀釋至10-3、10-4以及10-5水平，選取100 μL進行涂板，涂板選用沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂培養(yǎng)基(SS瓊脂培養(yǎng)基)，37 ℃培養(yǎng)24 h，對菌落進行計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計方法

用SAS 9.4中的一般線性模型(GLM)程序對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，方差分析差異顯著者，以LSD法比較平均值間的差異顯著性。統(tǒng)計結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽Sublancin和黃芪多糖對小鼠血清中細胞因子含量的影響

由表1可知，經(jīng)沙門氏菌攻毒3 h后，與空白

對照組相比，攻毒組血清中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α和MCP-1的含量顯著增加(P<0.05)。與攻毒組相比，12.0和48.0 mg/kg BW的黃芪多糖以及2.0 mg/kg BW的Sublancin顯著降低了血清中IL-6和IFN-γ的含量(P<0.05)；12.0和48.0 mg/kg BW的黃芪多糖顯著降低了血清中IL-10的含量(P<0.05)，1.0 mg/kg BW的Sublancin則顯著提高了血清中IL-10的含量(P<0.05)；12.0和48.0 mg/kg BW的黃芪多糖以及1.0和2.0 mg/kg BW的Sublancin均顯著降低了血清中TNF-α的含量(P<0.05)，同時12.0 mg/kg BW的黃芪多糖和1.0 mg/kg BW的Sublancin未對血清MCP-1含量產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。綜合上述指標，抗菌肽Sublancin和黃芪多糖均能調節(jié)沙門氏菌感染小鼠的免疫功能，但以1.0 mg/kg BW Sublancin的效果最好。

由表2可知，經(jīng)沙門氏菌攻毒24 h后，與空白對照組相比，攻毒組血清中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α和MCP-1的含量顯著增加(P<0.05)。與攻毒組相比，2.0 mg/kg BW的Sublancin顯著降低了血清中IL-6、IFN-γ、TNF-α和MCP-1的含量(P<0.05)；1.0 mg/kg BW的Sublancin對血清中除IFN-γ外的其他細胞因子的含量無顯著影響(P>0.05)；12.0 mg/kg BW的黃芪多糖顯著降低了血清中MCP-1的含量(P<0.05)，對血清中其他細胞因子含量無顯著影響(P>0.05)；48.0 mg/kg BW的黃芪多糖顯著降低了血清中IL-10、TNF-α和MCP-1的含量(P<0.05)。綜合上述指標，抗菌肽Sublancin對感染沙門氏菌小鼠24 h后的免疫調節(jié)效果略優(yōu)于黃芪多糖。

2.2 抗菌肽Sublancin和黃芪多糖對小鼠脾細胞中T淋巴細胞亞群數(shù)量及其比例的影響

表1 沙門氏菌攻毒3 h后抗菌肽Sublancin和黃芪多糖對小鼠血清中細胞因子含量的影響

表2 沙門氏菌攻毒24 h后抗菌肽Sublancin和黃芪多糖對小鼠血清中細胞因子含量的影響

2.3 抗菌肽Sublancin和黃芪多糖對小鼠腸道內容物中沙門氏菌數(shù)量的影響

由表5可知，沙門氏菌攻毒3 h后，空白對照組腸道內容物中沙門氏菌數(shù)量為0，與空白對照組相比，攻毒組腸道內容物中沙門氏菌的數(shù)量顯著增加(P<0.05)。與攻毒組相比，各劑量的Sublancin組與黃芪多糖組腸道內容物中沙門氏菌的數(shù)量沒有顯著變化(P>0.05)，但從數(shù)值上看2.0 mg/kg BW Sublancin組與48.0 mg/kg BW黃芪多糖組腸道內容物中沙門氏菌數(shù)量比攻毒組低。

3 討 論

表3 沙門氏菌攻毒3 h后抗菌肽Sublancin和黃芪多糖對小鼠脾細胞中T

表4 沙門氏菌攻毒24 h后抗菌肽Sublancin和黃芪多糖對小鼠脾細胞中

表5 沙門氏菌攻毒3 h后抗菌肽Sublancin和黃芪多糖對小鼠腸道內容物中沙門氏菌數(shù)量的影響

試驗研究證明，黃芪多糖對機體特異性免疫與非特異性免疫、細胞免疫與體液免疫有廣泛的影響。作為生物免疫調節(jié)劑，主要通過以下幾個途徑作用于機體的免疫系統(tǒng)：激活巨噬細胞；促進T細胞轉化；活化細胞毒性T(Tc)細胞；誘生多種免疫因子，如干擾素(IFN)、白細胞介素-2(IL-2)和腫瘤壞死因子(TNF)等[13]。林愛華等[16]試驗證明，黃芪可使刀豆蛋白A(ConA)激發(fā)的T淋巴細胞增殖反應明顯增強，有明顯的免疫增強作用。蔣瑞雪等[17]試驗證明，黃芪多糖具有顯著的免疫增強作用，且正常情況下，3.0 mg/kg的黃芪多糖可以顯著增強小鼠機體的先天性免疫和細胞免疫功能，是一種很好的免疫調節(jié)劑。此外，李樹義[18]的研究表明，黃芪多糖可以增強小鼠機體先天性免疫、細胞免疫和體液免疫功能。

研究表明黃芪多糖可以促進抑炎因子分泌[18]?？咕摩?防御素2(β-defensin 2)、hLF1-11和陽離子合成肽IDR-1018可以通過激活先天性免疫系統(tǒng)，啟動獲得性免疫，如誘導樹突狀細胞、巨噬細胞的分化[19-21]。抗菌肽LL37可以直接充當中性粒細胞、單核細胞、肥大細胞和T輔助(Th)細胞的趨化因子或刺激宿主細胞中性粒細胞和單核細胞趨化因子的釋放，使它們能快速聚集在炎癥反應部位，發(fā)揮其相應的功能并消除炎癥?？咕腖L37除了具有直接的趨化活性外，還能通過受體依賴機制刺激許多先天性免疫細胞釋放趨化因子和細胞因子而發(fā)揮間接趨化作用[22]。楊青[23]研究表明，適宜劑量的Sublancin可以誘導卵白蛋白(OVA)免疫小鼠產(chǎn)生Th1和Th2細胞混合型免疫反應，增強體液免疫和細胞免疫功能。本試驗結果表明，在小鼠感染沙門氏菌3 h后，與空白對照組相比，抗菌肽Sublancin和黃芪多糖可不同程度地提高血清中IL-10、IFN-γ和MCP-1的含量。IL-10是一種重要的抗炎性細胞因子，可抑制樹突狀細胞的成熟及產(chǎn)生IL-12，有助于樹突狀細胞誘導Th2細胞的免疫反應，IFN-γ則可通過上調轉錄因子T-bet促進Th1細胞免疫反應，MCP-1是機體最重要的免疫細胞趨化因子，上述結果說明，在急性感染期，抗菌肽Sublancin和黃芪多糖均對增加IL-10的表達存在有利作用，抗菌肽Sublancin則在促進Th1和Th2細胞免疫反應以及免疫趨化方面具有比黃芪多糖更加全面的作用。

先天免疫系統(tǒng)的過量激活和放大會對宿主造成損害，而抗菌肽則可以抑制體內過量的炎癥反應，如抑制細菌產(chǎn)物(如脂多糖、脂壁酸)誘導產(chǎn)生對宿主有害的細胞因子，抑制促炎性細胞因子(如IL-6、TNF-α)基因的轉錄，避免細菌產(chǎn)物(如脂多糖、脂壁酸)引起內毒素血癥的發(fā)生[24]。黃芪多糖可以在促進抑炎因子分泌的同時抑制促炎因子的分泌[18]。本實驗室前期研究表明，抗菌肽Microcin J25顯著降低了斷奶仔豬血清中IL-6、TNF-α等的含量，從而增強了斷奶仔豬的先天性免疫功能[25]。本試驗研究表明，在小鼠感染沙門氏菌3 h后，黃芪多糖和抗菌肽Sublancin顯著降低了血清中IL-6、TNF-α的含量；在小鼠感染沙門氏菌24 h后，抗菌肽Sublancin顯著降低了血清中IL-6、TNF-α的含量，黃芪多糖則僅能顯著降低血清中TNF-α的含量，同時黃芪多糖和抗菌肽Sublancin還不同程度地降低了血清中IFN-γ和MCP-1的含量，說明抗菌肽Sublancin和黃芪多糖都能抑制小鼠急性感染期促炎性細胞因子基因的轉錄；感染24 h后抗菌肽Sublancin和黃芪多糖則全面抑制炎癥反應，抗菌肽Sublancin比黃芪多糖的作用更全面。

在小鼠感染沙門氏菌3 h后，通過對其腸道內容物沙門氏菌數(shù)量進行檢測，發(fā)現(xiàn)各組之間不存在顯著差異，但是根據(jù)數(shù)值上可以看出，Sublancin和黃芪多糖具有降低腸道內容物中沙門氏菌數(shù)量的趨勢。

4 結 論

① 通過對比空白對照組和攻毒組相關指標可知，本試驗成功構建了沙門氏菌感染小鼠模型。

③ 與黃芪多糖相比，抗菌肽Sublancin對感染沙門氏菌小鼠免疫功能的調節(jié)更加全面。

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