史曉雪 牛占宇 幸 超 張三潤 閆婉姝 張潤厚*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)教研部，呼和浩特 010110)

近年來，我國特別是內(nèi)蒙古等邊疆少數(shù)民族地區(qū)肉羊業(yè)迅速發(fā)展，羊肉在肉類消費(fèi)中的比重不斷增加。但是，羊肉中脂肪含量較高，且40%的脂肪為飽和性脂肪，而飽和性脂肪與肥胖癥、高血壓、冠心病及各種癌癥有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，共軛亞油酸(CLA)具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、預(yù)防糖尿病、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、預(yù)防肥胖癥和促進(jìn)骨骼發(fā)育與健康等許多對人體有益的生物學(xué)功能[1]。因此，降低羊肉的飽和性脂肪含量，增加脂肪中CLA等功能性脂肪酸的比例，對于促進(jìn)消費(fèi)者健康具有重要意義。近些年有研究表明，乳脂中64%～78%的CLA是由反式油酸(TVA)經(jīng)硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)脫氫生成的[2]，牛肉中86%的CLA是由TVA經(jīng)SCD脫氫生成的[3]。也有研究表明，人體可以利用TVA合成CLA[4]。目前，關(guān)于CLA的內(nèi)源生成途徑在其他動物中研究較多，而在綿羊中研究較少。所以本試驗將通過在綿羊飼糧中添加SCD的抑制劑(梧桐子油)及促進(jìn)劑(羅格列酮)，分析其對綿羊背最長肌和皮下脂肪中脂肪酸的組成及含量的影響，來探討CLA等功能性脂肪酸在綿羊組織中的內(nèi)源合成機(jī)理，為生產(chǎn)富含CLA等功能性脂肪酸的羊肉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗設(shè)計及飼糧

本試驗按完全隨機(jī)分組方式進(jìn)行設(shè)計，將18只綿羊隨機(jī)分成3組：對照組(C組)、梧桐子油組(W組)、羅格列酮組(L組)，每組6只，實行單欄(2.0 m×1.2 m)飼養(yǎng)。各組飼糧設(shè)計如下：1)C組飼喂基礎(chǔ)飼糧+4.8%胡麻籽；2)W組飼喂C組飼糧+15 g/d梧桐子油；3)L組飼喂C組飼糧+8 mg/d羅格列酮?；A(chǔ)飼糧精粗比為60∶40?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。基礎(chǔ)飼糧脂肪酸組成及含量見表2。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗開始前對羊舍及周邊環(huán)境用聚維酮碘噴灑消毒，試驗用具進(jìn)行嚴(yán)格的清洗消毒。所有試驗羊在試驗開始前統(tǒng)一進(jìn)行驅(qū)蟲、注射疫苗。試驗羊每天在07：00和17：00進(jìn)行飼喂，自由飲水。試驗期為50 d，包括過渡期10 d，預(yù)試期5 d，正試期35 d。W組的梧桐子油與飼糧充分混勻后進(jìn)行飼喂；L組的羅格列酮于飼喂前進(jìn)行投放(口服)。

1.4 樣品采集及處理

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，將所有試驗羊拉到附近的屠宰場進(jìn)行屠宰，屠宰前綿羊禁食12 h，自由飲水。綿羊宰殺放血后，采集背最長肌和皮下脂肪樣品各100 g左右，迅速置于液氮中冷凍，待轉(zhuǎn)移回實驗室后于-20 ℃下保存，用于組織中脂肪酸組成及含量的測定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet:I(as potassium iodide)55 mg,Mn(as manganese sulfate)1 750 mg,Co (as cobalt chloride)25 mg,Se (as sodium selenite)22.5 mg,Fe (as ferrous sulfate)3 000 mg,Zn (as zinc sul-fate)2 000 mg,VA 400 000 IU,VD 30 000 IU,VE 3 000 IU。

2)粗蛋白質(zhì)為實測值，其他均為計算值。CP was a measured value, while the others were calculated values.

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 基礎(chǔ)飼糧中脂肪酸的組成及含量分析方法

準(zhǔn)確稱取0.5 g飼料樣品放置于耐高溫試管(帶聚四氟乙烯材料的蓋子)中；在飼料樣品中準(zhǔn)確加入1 mL無水甲醇和1 mL 2%氫氧化鈉甲醇(將2 g氫氧化鈉溶于100 mL含水不超過0.5%的甲醇中，混勻，該溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配)和0.5 mL正己烷，旋緊蓋子50 ℃水浴15 min，取出冷卻后加入4 mL 10%鹽酸甲醇(10 mL乙酰氯慢慢加入到100 mL無水甲醇中，混勻)，旋緊蓋子于90 ℃下水浴2 h，中間要防止漏氣，并且水浴過程中要輕微搖晃試管；水浴完畢后，取出冷卻到室溫，加入2 mL正己烷和15 mL蒸餾水，混勻，靜置10 min；轉(zhuǎn)移有機(jī)層于事先準(zhǔn)備好的干凈的10 mL容量瓶中，靜置5 min，再加入1 g的無水硫酸鈉進(jìn)行干燥；最后吸取有機(jī)層進(jìn)行氣相色譜儀分析。

表2 基礎(chǔ)飼糧、胡麻籽、梧桐子油中的脂肪酸組成及含量(占總脂肪酸比例)

1.5.2 梧桐子油中脂肪酸的組成及含量分析方法

準(zhǔn)確吸取200 μL的梧桐子油放入10 mL試管中；取2 mL石油醚∶苯=1∶1的溶液于試管中；充分振蕩混勻，取2 mL 0.4 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液(精確稱取2.24 g氫氧化鉀固體溶于100 mL甲醇中,混勻)于試管中；充分振蕩混勻后沿試管壁加入8 mL蒸餾水，靜置15 min；最后吸取有機(jī)層進(jìn)行氣相色譜儀分析。

1.5.3 背最長肌及皮下脂肪中脂肪酸的組成及含量分析方法

取100 mg樣品加入到15 mL離心管中；加入2 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液，于85 ℃水浴鍋中水浴30 min；加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，于85 ℃水浴鍋中水浴30 min；水浴完成后，等溫度降到室溫，在離心管中加入1 mL正己烷，振蕩萃取2 min之后，靜置1 h，等待分層；取上層清液100 μL，用正己烷定容到1 mL。用0.45 μm濾膜過膜后上機(jī)測試。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理后，采用SAS 9.1統(tǒng)計軟件中one-way ANOVA進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行。P<0.05作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加梧桐子油和羅格列酮對綿羊背最長肌中脂肪酸組成及含量的影響

由表3可知，各組綿羊背最長肌中單不飽和脂肪酸(MUFA)含量和n-6/n-3差異不顯著(P>0.05)，但與C組相比，L組背最長肌中飽和脂肪酸(SFA)的含量顯著降低(P<0.05)，多不飽和脂肪酸(PUFA)含量及PUFA/SFA顯著增加(P<0.05)。與C組相比，W組反-11油酸(trans-11 C18∶1)、反-9，12亞油酸(trans-9,12 C18∶2)的含量顯著增加(P<0.05)，亞麻酸(C18∶3)(n-6)的含量顯著降低(P<0.05)，對其他脂肪酸的含量沒有顯著影響(P>0.05)；L組trans-11 C18∶1、trans-9,12 C18∶2和順-9,反-11共軛亞油酸(cis-9，trans-11 CLA) 的含量顯著增加(P<0.05)，C18∶3(n-6)的含量顯著降低(P<0.05)，對其余脂肪酸含量無顯著影響(P>0.05)。與W組相比，L組trans-11 C18∶1和cis-9，trans-11 CLA的含量顯著增加(P<0.05)，而癸酸(C10∶0)的含量顯著降低(P<0.05)。

2.2 飼糧中添加梧桐子油和羅格列酮對綿羊皮下脂肪中脂肪酸組成及含量的影響

由表4可知，各組綿羊皮下脂肪中SFA、MUFA、PUFA含量及PUFA/SFA和n-6/n-3的差異均不顯著(P>0.05)。與C組相比，W組皮下脂肪中花生烯酸(C20∶1)含量顯著升高(P<0.05)，L組皮下脂肪中C10∶0、cis-9 C18∶1和花生三烯酸(C20∶3)(n-3)含量顯著升高(P<0.05)，其余脂肪酸含量沒有顯著變化(P>0.05)。與W組相比，L組C10∶0、硬脂酸(C18∶0)、cis-9 C18∶1和C20∶3(n-3)的含量顯著增加(P<0.05)，十一碳酸(C11∶0)、銀杏酸(C13∶0)、十五碳酸(C15∶0)和C20∶1的含量顯著降低(P<0.05)，且在L組皮下脂肪中未檢測到順-9,反-11共軛亞油酸(cis-12，trans-10 CLA)。

表3 飼糧中添加梧桐子油和羅格列酮對綿羊背最長肌中脂肪酸組成及含量的影響(占總脂肪酸比例)

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)相同或不標(biāo)注者表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表4 飼糧中添加梧桐子油和羅格列酮對綿羊皮下脂肪中脂肪酸組成及含量的影響(占總脂肪酸比例)

3 討 論

3.1 綿羊飼糧中梧桐子油和羅格列酮添加量的確定

CLA存在于動物的肉制品及奶制品、海產(chǎn)品和植物性食品中，但它的含量和生物活性存在著較大的差異。具有較高生物活性的CLA主要來源于反芻動物產(chǎn)品中，且75%以上的是cis-9,trans-11 CLA[5]。由于CLA具有抗癌、抗動脈硬化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、減緩免疫系統(tǒng)副反應(yīng)、預(yù)防肥胖病、改善肉品質(zhì)和調(diào)節(jié)代謝等許多生理功能。所以，目前關(guān)于CLA的合成、來源以及如何提高動物產(chǎn)品中CLA的含量的研究備受關(guān)注。在反芻動物組織中CLA內(nèi)源合成的重要底物是TVA。有研究表明，當(dāng)反芻動物采食了富含C18∶3的飼料時，C18∶3進(jìn)入瘤胃經(jīng)過生物加氫作用產(chǎn)生中間體TVA，然后經(jīng)乳腺等組織中的SCD去飽和后形成CLA，且78%的CLA是由TVA經(jīng)SCD的脫氫去飽和作用合成的[6]。因此，本試驗在綿羊的基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加4.8%的胡麻籽，就是為了增加內(nèi)源合成CLA的前體物TVA的含量。

本試驗選用梧桐子油作為SCD的活性抑制劑。本研究表明，梧桐子油中含有大量不飽和脂肪酸，其中主要包含22.83%的油酸(C18∶1)、27.81%的亞油酸(C18∶2)和23.22%的蘋婆酸。研究報道，SCD1的活性和基因表達(dá)會受到飼糧中脂肪酸組成和飽和度的影響，飼糧中的SFA含量對組織中SCD1的活性具有升高的作用，而PUFA則相反，對其活性具有抑制作用[6]。Kay等[7]曾將富含蘋婆酸的蘋婆油作為SCD的活性抑制劑在奶牛飼養(yǎng)試驗中運(yùn)用，并得到較好的抑制效果。Griinari等[2]通過給產(chǎn)后200 d左右的泌乳奶牛真胃灌注10 g/d蘋婆油，分析發(fā)現(xiàn)奶牛乳脂中的CLA主要是由TVA通過SCD內(nèi)源合成的。由于蘋婆油和梧桐子油中蘋婆酸的含量接近，所以本試驗用梧桐子油代替蘋婆油，按綿羊體重計算應(yīng)真胃灌注1.5 g/d的梧桐子油，由于本試驗采用直接飼喂法，考慮到PUFA在瘤胃內(nèi)的氫化可達(dá)到90%左右，因此本試驗在綿羊飼糧中添加15 g/d富含蘋婆酸的梧桐子油進(jìn)行飼養(yǎng)試驗。本試驗選用羅格列酮作為SCD的活性促進(jìn)劑，由于羅格列酮是噻唑烷二酮類胰島素增敏劑藥物，能明顯增強(qiáng)靶組織對胰島素的敏感性，具有抗胰島素抵抗的作用。胰島素是SCD基因轉(zhuǎn)錄高效促進(jìn)劑，該激素對SCD的影響已在小鼠、牛、雞、人的體內(nèi)和體外試驗中得到了證實[8]。有報道指出，給患有Ⅱ型糖尿病患者服用8 mg/d羅格列酮后，可以增加SCD的活性和基因表達(dá)[9]。為了不影響綿羊的健康狀況，本試驗在綿羊飼糧中添加8 mg/d羅格列酮進(jìn)行飼養(yǎng)試驗。

3.2 飼糧中添加梧桐子油和羅格列酮對綿羊生產(chǎn)性能的影響

綿羊飼糧中添加梧桐子油和羅格列酮的研究表明，梧桐子油和羅格列酮對綿羊的初體重、末體重、平均日增重(ADG)和干物質(zhì)采食量(DMI)等生產(chǎn)性能指標(biāo)及屠宰率無顯著影響[10]。其中梧桐子油組與前人的研究結(jié)果基本一致。有研究表明，在山羊飼糧中添加豆油或葵花油對DMI無顯著影響，可能是因為各試驗組飼糧的代謝能水平基本相同[11]。趙天章[1]在巴美肉羊飼糧中添加2.4%的魚油、葵花油或二者混合油脂，結(jié)果顯示對巴美肉羊的生產(chǎn)性能指標(biāo)無顯著影響。Ferreira等[12]在育肥綿羊飼糧中添加魚油或魚油與豆油的混合油脂對其DMI、ADG和末體重均無顯著影響。本課題組育肥綿羊飼糧中添加梧桐子油雖然對其生產(chǎn)性能各指標(biāo)的影響不大，但在數(shù)值上與C組相比，W組有所提高[10]，有可能是因為梧桐子油增加了飼料的適口性，使其采食量增加而導(dǎo)致的結(jié)果。羅格列酮作為胰島素增敏劑藥物添加在綿羊的飼糧中，對其生產(chǎn)性能指標(biāo)無顯著影響，但降低了飼料報酬，可能是由于羅格列酮降低了綿羊的血清葡萄糖含量，從而導(dǎo)致胰高血糖素分泌增加，進(jìn)而促進(jìn)脂肪的分解所致。目前，還未見到在綿羊飼糧中添加羅格列酮的相關(guān)報道。

3.3 飼糧中添加梧桐子油和羅格列酮對綿羊組織中脂肪酸含量的影響

動物脂肪酸組成受品種、屠宰年齡及營養(yǎng)等多種因素的影響，通過飼糧調(diào)控可改變動物組織中PUFA的含量，尤其是改變CLA在動物體組織中的沉積。反芻動物肉和奶及其制品是人類CLA的主要來源，在飼糧中添加富含PUFA的飼料是提高反芻動物產(chǎn)品中CLA含量的一個重要方法。有研究表明，在飼糧中添加富含PUFA的油脂飼料來提高反芻動物產(chǎn)品中CLA的含量是2種機(jī)制共同作用的結(jié)果：一種是增加了瘤胃內(nèi)氫化合成CLA及組織內(nèi)源合成CLA的底物；另一種是PUFA對組織中SCD基因的表達(dá)起到抑制作用，減少了TVA向CLA的轉(zhuǎn)變，而底物增加效應(yīng)高于PUFA對SCD基因表達(dá)的抑制效應(yīng)。因此，在反芻動物飼糧中添加PUFA的油脂飼料可以使其產(chǎn)品中CLA含量升高[3，13]。本試驗通過在綿羊飼糧中添加SCD的抑制劑和促進(jìn)劑來探索CLA等功能性脂肪酸在綿羊組織中的內(nèi)源合成機(jī)理具有重要意義。有研究表明，在奶牛飼糧中添加分別富含亞油酸、C18∶3和油酸的葵花油、胡麻油和菜籽油均可以提高其乳脂中TVA和CLA的含量[14]。在延邊黃牛飼糧中補(bǔ)飼整粒亞麻籽和破碎亞麻籽均提高了其背最長肌、皮下脂肪、肌間脂肪中CLA的含量[6]。趙天章[1]在巴美肉羊飼糧中添加葵花油顯著提高了組織中cis-9，trans-11 CLA和cis-12，trans-10 CLA的含量。陳雪君[15]在羊飼糧中添加豆油或玉米油都顯著增加了TVA、cis-9，trans-11 CLA、cis-12，trans-10 CLA及CLA含量。富含蘋婆酸的蘋婆油可以提高細(xì)胞中TVA含量，但使其向cis-9，trans-11 CLA的轉(zhuǎn)化率明顯降低[16]。奶牛真胃灌注蘋婆油可以抑制SCD活性，且使cis-9，trans-11 CLA的含量降低70%[17]。本試驗添加梧桐子油后對背最長肌中trans-11 C18∶1和trans-9,12 C18∶2的含量顯著由于梧桐子油增加了瘤胃內(nèi)氫化合成CLA及其前體物TVA的含量，但由于梧桐子油中富含的蘋婆酸是SCD的有效抑制劑，且之前試驗結(jié)果也提高，對C18∶3(n-6)的含量顯著下調(diào)，而對其他脂肪酸的含量無顯著影響，這可能是顯示梧桐子油可以有效抑制綿羊背肌中SCD的活性和基因表達(dá)，所以梧桐子油可以通過降低TVA向CLA的轉(zhuǎn)化率從而阻斷cis-9，trans-11 CLA含量的增加。本試驗添加梧桐子油后對皮下脂肪中trans-11 C18∶1、cis-9，trans-11 CLA和cis-12，trans-10 CLA沒有顯著影響，可能是由于不同組織對脂肪酸的沉積不一致，也可能因為添加梧桐子油后對皮下脂肪中脂肪酸代謝相關(guān)酶基因表達(dá)沒有產(chǎn)生影響(之前試驗結(jié)果)有關(guān)。另外，本試驗顯示添加梧桐子油可以顯著增加皮下脂肪中C20∶1的含量。羅格列酮是SCD的有效促進(jìn)劑，可以通過提高SCD的基因表達(dá)使SFA生成MUFA，也可以將TVA轉(zhuǎn)化生成cis-9，trans-11 CLA，所以本試驗結(jié)果顯示添加羅格列酮可以增加綿羊背最長肌中trans-11 C18∶1、trans-9,12 C18∶2、cis-9，trans-11 CLA、PUFA的含量及PUFA/SFA，并使其SFA含量降低；另外，羅格列酮降低了背最長肌中C18∶3(n-6)的含量，增加了皮下脂肪中C10∶0、cis-9 C18∶1和C20∶3(n-3)的含量，且在皮下脂肪中沒有檢測到cis-12，trans-10 CLA的含量。根據(jù)以上結(jié)果，猜測羅格列酮可能有提高n-3 PUFA和降低n-6 PUFA的作用，由于沒有相關(guān)內(nèi)容的研究，此猜測有待考證。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加梧桐子油增加了綿羊背最長肌中trans-11 C18∶1、trans-9,12 C18∶2的含量，降低了C18∶3(n-6)的含量，增加了皮下脂肪中C20∶1的含量。

② 飼糧中添加羅格列酮增加了綿羊背最長肌中trans-11 C18∶1、trans-9,12 C18∶2和cis-9，trans-11 CLA的含量，降低了C18∶3(n-6)的含量，增加了皮下脂肪中C10∶0、cis-9 C18∶1和C20∶3(n-3)的含量。

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