劉志友 李胤豪 閆素梅* 史彬林 趙啟龍 張鵬飛
(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010018; 2.赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究院,赤峰 024031)
雞蛋是雞胚發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)的唯一來源,其所含能量是雞胚生長發(fā)育的第一限制性因素。雞蛋中的蛋白質(zhì)主要用于組織生長,而蛋黃中的脂質(zhì)則是胚胎發(fā)育的主要能量來源。蛋種雞脂質(zhì)代謝活躍,以此滿足蛋黃脂質(zhì)沉積的需要。因此,有效調(diào)節(jié)蛋種雞的脂質(zhì)代謝對改善機(jī)體健康、提高其生產(chǎn)性能具有重要的意義。
血清中脂類物質(zhì)及脂肪細(xì)胞因子含量是反映動物脂質(zhì)代謝的重要指標(biāo)。研究表明殼聚糖及其衍生物因含有氨基和羥基等具有生物活性的功能基團(tuán),在動物飼糧中適量添加后具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的功效[1]。目前有關(guān)殼聚糖對禽類脂質(zhì)代謝影響的相關(guān)報(bào)道較少。Zhou等[2]發(fā)現(xiàn),飼糧中添加0.14%或0.28%的殼聚糖可以降低肉仔雞的腹脂率,提高血液中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量,并且改善胸肌的肉質(zhì),降低胸肌中總飽和脂肪酸的含量,增加單不飽和脂肪酸的含量。Kobayashi等[3]報(bào)道,高脂飼糧中添加0.5%的殼聚糖對雞的生長性能無顯著影響,但可以降低腹脂率及小腸內(nèi)脂肪酶的活性。然而,也有一些不同的研究結(jié)果。Keser等[4]在肉雞飼糧中添加0.025%殼聚糖后發(fā)現(xiàn),殼聚糖僅降低了血液中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量,對生長性能及血液中總膽固醇(TC)、HDL-C、甘油三酯(TG)的含量并無顯著影響。鑒于不同研究者所得結(jié)論不盡一致,且添加量存在差異,尤其是針對蛋種雞的研究報(bào)道甚少,本試驗(yàn)擬通過在基礎(chǔ)飼糧中添加不同水平的殼聚糖,研究其對蛋種雞血清中脂類物質(zhì)及脂肪細(xì)胞因子含量的影響,探討殼聚糖對蛋種雞脂質(zhì)代謝的影響,為深入研究殼聚糖對蛋種雞脂質(zhì)代謝的影響機(jī)制并改善其脂質(zhì)代謝提供理論依據(jù)。
試驗(yàn)選擇26周齡健康海蘭褐蛋種雞450只,根據(jù)體重和產(chǎn)蛋率相近的原則,隨機(jī)分為5組,每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)15只雞。對照組飼喂不添加殼聚糖的基礎(chǔ)飼糧,4個(gè)試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg殼聚糖的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)所用殼聚糖由山東濟(jì)南海德
貝海洋生物工程有限公司提供,脫乙酰度84.15%,黏度45 cps。試驗(yàn)期為56 d。基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1994)蛋種雞營養(yǎng)需要配制,其組成及營養(yǎng)水平見表1。蛋種雞采用有窗封閉雞舍3層立體籠養(yǎng),試驗(yàn)期間自由采食、自由飲水,每天光照16 h。各組雞舍環(huán)境條件及飼養(yǎng)管理均保持一致,定期消毒,按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。
1.2.1 樣品采集與處理
在試驗(yàn)第28天和第56天,每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只雞,翅靜脈采血4 mL/只,1 000×g離心10 min,收集上清液,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采血后處死,取肝臟并用預(yù)冷的生理鹽水沖洗表面血漬后,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 測定指標(biāo)與方法
采用單試劑甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶(GPO-PAP)法測定血清中TG、TC含量,雙試劑直接法測定血清中HDL-C、LDL-C含量,比色法測定血清和肝臟中游離脂肪酸(FFA)含量,酶聯(lián)免疫法測定血清中瘦素(LEP)、脂聯(lián)素(ADP)含量,放射免疫法測定血清中極低密度脂蛋白(VLDL)含量。上述指標(biāo)均用試劑盒測定,試劑盒購于南京建成生物工程研究所,具體測定過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet:Mn 50 mg,F(xiàn)e 25 mg,Cu 2.5 mg,Zn 50 mg,I 1.0 mg,Se 0.15 mg,VA 7 715 IU,VD 2 755 IU,VE 8.8 IU,VK 2.2 mg,VB110.55 mg,VB28.0 mg,VB624.41 mg,VB12120.01 mg,煙酸 nicotinic acid 19.8 mg,葉酸 folic acid 0.28 mg,生物素 biotin 2 mg,泛酸鈣 calcium pantothenate 50 mg。
2)代謝能為計(jì)算值,其余為實(shí)測值。ME was a calculated value, while the others were measured values.
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.1.3軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)以及一次線性和二次曲線回歸分析。P≤0.05表示組間差異或回歸關(guān)系顯著,0.05
由表2可知,試驗(yàn)第28天時(shí),與對照組相比,250、500和1 000 mg/kg殼聚糖組蛋種雞血清中TG含量顯著降低(P≤0.05),其中以500 mg/kg殼聚糖組最低,但2 000 mg/kg殼聚糖組與對照組差異不顯著(P>0.05);隨著殼聚糖添加水平的升高,血清中TG含量呈現(xiàn)顯著的二次曲線變化(R2=0.839 9,P<0.01)。試驗(yàn)第56天時(shí),250 mg/kg殼聚糖組血清中TG含量顯著低于對照組(P≤0.05),500 mg/kg殼聚糖組也有降低的趨勢,但與對照組差異不顯著(P>0.05)。除試驗(yàn)第56天時(shí)250 mg/kg殼聚糖組與對照組差異不顯著(P>0.05)外,試驗(yàn)第28天和第56天時(shí)各殼聚糖組血清中TC含量均顯著低于對照組(P≤0.05),且隨著殼聚糖添加水平的升高,試驗(yàn)第28天和第56天時(shí)蛋種雞血清中TC含量均呈現(xiàn)顯著的線性下降(第28天:R2=0.649 0,P<0.01;第56天:R2=0.568 4,P<0.01)。試驗(yàn)第28天時(shí),250 mg/kg殼聚糖組血清中HDL-C含量顯著高于對照組(P≤0.05),而500、1 000和2 000 mg/kg殼聚糖組則與對照組沒有顯著差異(P>0.05);隨著殼聚糖添加水平的升高,血清中HDL-C含量呈現(xiàn)顯著的二次曲線變化(R2=0.855 5,P<0.01)。試驗(yàn)第56天時(shí),各殼聚糖組蛋種雞血清中HDL-C含量與對照組均沒有顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)第28天時(shí),250 mg/kg殼聚糖組血清中LDL-C含量顯著低于對照組和2 000 mg/kg殼聚糖組(P≤0.05);試驗(yàn)第56天時(shí),各殼聚糖組血清中LDL-C含量均顯著低于對照組(P≤0.05)。試驗(yàn)第28天時(shí),500 mg/kg殼聚糖組蛋種雞血清中VLDL含量顯著低于其他組(P≤0.05),250 mg/kg殼聚糖組顯著低于1 000和2 000 mg/kg殼聚糖組(P≤0.05);隨著殼聚糖添加水平的升高,血清中VLDL含量呈現(xiàn)顯著的二次曲線變化(R2=0.407 7,P<0.01)。試驗(yàn)第56天時(shí),各殼聚糖組蛋種雞血清中VLDL含量均低于對照組,但是差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。
試驗(yàn)第28天時(shí),250、500和1 000 mg/kg殼聚糖組蛋種雞血清中FFA含量顯著低于對照組(P≤0.05),且隨殼聚糖添加水平的升高,血清中FFA含量呈顯著的二次曲線變化(R2=0.359 2,P=0.04);試驗(yàn)第56天時(shí),250和500 mg/kg殼聚糖組蛋種雞血清中FFA含量顯著低于對照組和其他殼聚糖組(P≤0.05)。試驗(yàn)第28天時(shí),250和500 mg/kg殼聚糖組肝臟FFA含量顯著低于對照組(P≤0.05),其中以250 mg/kg殼聚糖組最低,1 000、2 000 mg/kg殼聚糖組則與對照組無顯著差異(P>0.05);試驗(yàn)第56天時(shí),250 mg/kg殼聚糖組肝臟FFA含量顯著低于對照組(P≤0.05),其他殼聚糖組則與對照組無顯著差異(P>0.05)。
表2 飼糧添加殼聚糖對蛋種雞血清脂類物質(zhì)含量與肝臟FFA含量的影響
續(xù)表2項(xiàng)目Items時(shí)間Time殼聚糖添加水平 Chitosan supplemental level/(mg/kg)02505001 0002 000均值標(biāo)準(zhǔn)誤SEMP值 P-value組間 Group線性Linear二次Quadratic低密度脂蛋白膽固醇LDL-C/(mmol/L)第28天 Day 281.43a1.22b1.26ab1.36ab1.40a0.050.030.240.12第56天 Day 561.45a1.30b1.28b1.30b1.31b0.030.020.250.35極低密度脂蛋白VLDL/(mmol/L)第28天 Day 280.59ab0.45bc0.29c0.63a0.66a0.07<0.01<0.01<0.01第56天 Day 560.630.430.460.560.50a0.040.150.480.34游離脂肪酸FFA/(μmol/L)第28天 Day 28708.74a440.13bc276.70c450.92bc597.63ab65.21<0.010.170.04第56天 Day 56685.01a399.68c450.36bc619.74ab676.38a54.190.010.630.23肝臟脂肪酸 Liver FFA/(μmol/g prot)第28天 Day 2891.02a55.48c67.64bc75.21ab78.56ab5.450.010.940.41第56天 Day 56140.72a92.63b106.63ab135.81a133.78a11.000.030.240.44
同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05),相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。
In the same row, values without the same small letter superscripts mean significant difference (P≤0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.
由表3可知,試驗(yàn)第28天時(shí),與對照組相比,飼糧添加250、500、1 000和2 000 mg/kg殼聚糖均顯著降低了血清中LEP含量(P≤0.05)。試驗(yàn)第56天時(shí),飼糧添加250、500、1 000和2 000 mg/kg殼聚糖對蛋種雞血清LEP含量無顯著影響(P>0.05)。試驗(yàn)第28天和第56天時(shí),飼糧添加250、500、1 000和2 000 mg/kg殼聚糖對蛋種雞血清中ADP含量均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。
表3 飼糧添加殼聚糖對蛋種雞血清中脂肪細(xì)胞因子含量的影響
血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C等脂類物質(zhì)的含量是動物機(jī)體脂質(zhì)代謝健康水平的重要指示劑。TG含量過高時(shí)凝血發(fā)生幾率增高,促使動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展,同時(shí)導(dǎo)致脂肪肝和肥胖癥等相關(guān)并發(fā)癥。TC含量過高,易累積在動脈壁上,從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化。本研究結(jié)果表明,飼糧添加殼聚糖可不同程度降低蛋種雞血清中TG、TC和LDL-C含量,增加HDL-C含量,提示殼聚糖的添加有利于改善蛋種雞血清的脂質(zhì)代謝健康水平。關(guān)于殼聚糖調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的機(jī)制最早提出的是脂質(zhì)結(jié)合機(jī)制,殼聚糖氨基所帶正電荷促使其與脂肪酸和膽汁酸等陰離子物質(zhì)結(jié)合,導(dǎo)致腸道脂質(zhì)吸收中斷及膽汁酸的排泄,同時(shí)為了彌補(bǔ)糞便損失,肝臟中的TC加速轉(zhuǎn)化為膽汁酸[5],因此,殼聚糖表現(xiàn)出降脂、降膽固醇的作用。HDL-C具有逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇至肝臟的作用,引起動物血漿中HDL-C含量升高。LDL-C是血液中膽固醇的主要載體,轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇到外周組織,并調(diào)節(jié)這些部位的膽固醇從頭合成,促進(jìn)脂肪沉積。此外,殼聚糖被認(rèn)為是胰脂肪酶的競爭性抑制劑,可降低脂質(zhì)和膽固醇的吸收[6]。因此,殼聚糖可降低蛋種雞血清中TG和TC含量,但其確切的機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果還表明,殼聚糖對蛋種雞血清中TG和TC含量的降低效果與劑量相關(guān)。飼糧添加殼聚糖(250、500和1 000 mg/kg)對血清TG含量的降低作用較大;試驗(yàn)第28天時(shí),依據(jù)回歸方程得出殼聚糖添加水平為967.18 mg/kg時(shí),蛋種雞血清中TG含量最低。而隨著殼聚糖添加水平的升高,殼聚糖線性降低蛋種雞血清中TC含量。此外,250和500 mg/kg殼聚糖調(diào)節(jié)血清HDL-C和LDL-C含量的能力優(yōu)于1 000和2 000 mg/kg殼聚糖,提示低劑量殼聚糖對蛋種雞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于高劑量;試驗(yàn)第28天時(shí),依據(jù)回歸方程得出殼聚糖添加水平為734.61 mg/kg時(shí),蛋種雞血清中HDL-C含量最高。
肝臟是禽類脂質(zhì)合成的主要場所。肝臟內(nèi)TG的合成與分解失去平衡,則會導(dǎo)致TG在肝細(xì)胞內(nèi)的過度沉積,進(jìn)而誘發(fā)脂肪肝,造成產(chǎn)蛋率下降。相對于從頭合成以及飼糧來源的脂肪酸,F(xiàn)FA可直接納入VLDL-TG[7]。Koutsari等[8]證明,F(xiàn)FA是VLDL-TG的主要脂肪酸來源。其他研究也證明,F(xiàn)FA是肝臟TG合成的主要脂肪酸來源[9]。因此,肝臟TG過剩的關(guān)鍵點(diǎn)是肝臟中脂肪酸可利用度增加。在本研究中,飼糧添加殼聚糖降低了蛋種雞肝臟FFA含量,導(dǎo)致可合成TG總量減少,從而適當(dāng)限制蛋種雞肝臟內(nèi)因產(chǎn)蛋需求所造成的TG過度合成,防止TG在肝細(xì)胞內(nèi)大量沉積。同時(shí),動物肝臟吸收FFA的能力與其在血液中的含量成正比[10]。在本研究中,飼糧添加殼聚糖降低了蛋種雞血清中FFA含量。血清中FFA含量的下降會影響肝臟對FFA的吸收,這也是造成蛋種雞肝臟FFA含量下降的原因。此外,F(xiàn)FA酯化形成TG可以防止細(xì)胞內(nèi)脂肪酸沉積所引起的肝損傷或功能障礙。非脂肪細(xì)胞和組織慢性暴露于高含量的脂肪酸所引發(fā)的不良影響被稱為“脂毒性”[11]。脂肪酸不能被酯化是造成“脂毒性”的主要原因。因此,飼糧添加殼聚糖降低蛋種雞血清和肝臟中FFA的含量,除限制TG在肝臟內(nèi)的過度沉積外,還可以減輕FFA的細(xì)胞毒性,防止肝損傷,提升蛋種雞的脂質(zhì)代謝健康水平。此外,本研究結(jié)果顯示,試驗(yàn)第28天時(shí),飼糧添加250、500和1 000 mg/kg殼聚糖可顯著降低血清FFA含量,依據(jù)回歸方程得出殼聚糖添加水平為856.67 mg/kg時(shí),血清FFA含量最低。此外,250和500 mg/kg殼聚糖對試驗(yàn)第56天時(shí)血清和肝臟中FFA含量的降低效果優(yōu)于2 000 mg/kg殼聚糖。這說明殼聚糖對蛋種雞血清和肝臟中FFA含量的降低作用與其添加劑量有關(guān),低劑量組的調(diào)節(jié)作用較好,高劑量組調(diào)節(jié)作用減弱。
脂類物質(zhì)在體內(nèi)的運(yùn)輸主要通過VLDL和乳糜微粒等脂蛋白顆粒來完成,VLDL含量升高能夠保證母雞性成熟后旺盛的產(chǎn)蛋脂質(zhì)需求,同時(shí)高VLDL含量也容易誘發(fā)脂肪肝,影響蛋雞產(chǎn)蛋性能。血液中脂蛋白含量是脂類物質(zhì)在血液中的“出現(xiàn)率”和“清除率”之間相互平衡的結(jié)果。安光全[12]發(fā)現(xiàn),隨著血清VLDL含量的增大,蛋雞的產(chǎn)蛋量呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢;血清VLDL含量小于400 mg/mL時(shí),與產(chǎn)蛋量呈顯著的正相關(guān),血清VLDL含量大于400 mg/mL時(shí),與產(chǎn)蛋量呈顯著的負(fù)相關(guān)。陳媛媛[13]也得出了相似的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示,250和500 mg/kg殼聚糖組產(chǎn)蛋率分別為94.14%和95.19%,對照組、1 000和2 000 mg/kg殼聚糖組產(chǎn)蛋率分別為90.52%、93.06%和93.30%[14],與本研究得出的血清VLDL含量變化規(guī)律相反,提示不同劑量殼聚糖可能通過調(diào)節(jié)蛋種雞血清VLDL含量影響其產(chǎn)蛋性能;但在試驗(yàn)第56天時(shí),飼糧添加殼聚糖對蛋種雞血清VLDL含量的影響未產(chǎn)生顯著效果,可能是由于蛋種雞進(jìn)入產(chǎn)蛋高峰期,血清中VLDL含量需要保持在高水平,進(jìn)而滿足產(chǎn)蛋脂質(zhì)需求,確切的機(jī)理需要進(jìn)一步研究。此外,殼聚糖對蛋種雞血清VLDL含量的調(diào)節(jié)存在劑量效應(yīng),試驗(yàn)第28天時(shí),依據(jù)回歸方程得出,殼聚糖添加水平為652.56 mg/kg時(shí)蛋種雞血清VLDL含量最低。由此可見,殼聚糖對蛋種雞血清TG、VLDL、HDL-C、FFA含量的調(diào)節(jié)作用呈劑量效應(yīng),同時(shí)根據(jù)上述指標(biāo)的回歸分析結(jié)果獲得殼聚糖的適宜添加水平依次為967.18、652.56、734.61和856.67 mg/kg。這些結(jié)果說明,殼聚糖添加劑量在652.56~967.18 mg/kg時(shí)對蛋種雞血清TG、HDL-C、VLDL和FFA含量有較好的調(diào)節(jié)效果,也進(jìn)一步說明添加高劑量的殼聚糖對蛋種雞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用減弱,但殼聚糖的添加劑量究竟為多少更有利于調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,今后還需要進(jìn)一步在500~1 000 mg/kg劑量之間增加劑量組以更深入地探討。
LEP是一種由白色脂肪細(xì)胞合成和分泌的肥胖基因編碼的多肽類激素,其最主要、最基本的作用是調(diào)節(jié)脂肪代謝、降低機(jī)體內(nèi)脂肪沉積。LEP抵抗小鼠表現(xiàn)出高膽固醇血癥、高TC血癥、肝臟脂肪變性和脂肪耐受受損等癥狀[15]。肥胖老鼠和肥胖人類的血清LEP含量與體脂量成正比,同時(shí)血清LEP含量與TC、TG、VLDL、LDL-C含量呈正相關(guān),而與HDL-C含量呈負(fù)相關(guān)[15-16]。發(fā)生LEP抵抗的小鼠肝臟LEP信號缺乏,血漿脂蛋白異常重塑,VLDL-TG含量升高[15]。鑒于肝臟在脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵作用,因此研究者認(rèn)為血脂異常風(fēng)險(xiǎn)的增加是由肝臟LEP抵抗造成的。在本研究中,飼糧添加不同水平的殼聚糖均可顯著降低蛋種雞血清中LEP含量,說明殼聚糖對蛋種雞血清TC、TG、VLDL、LDL-C和HDL-C含量的調(diào)節(jié)作用與LEP有關(guān)。此外,高含量的LEP刺激TG水解及脂肪酸的釋放和氧化,并降低總脂肪酸的攝取。LEP通過提高甘油三酯脂肪酶和激素敏感酯酶活性刺激脂解作用的增加,釋放FFA[17]。Jaubert等[18]研究發(fā)現(xiàn),LEP刺激一氧化氮的生成,進(jìn)而抑制甘油的合成,減少脂肪酸再酯化的機(jī)會。William等[19]在LEP條件下孵育脂肪細(xì)胞,采用放射性標(biāo)記技術(shù)測定培養(yǎng)細(xì)胞中的脂肪酸流入(脂肪酸合成TG)和脂肪酸流出(細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化和FFA釋放),結(jié)果顯示TG水解率增加了123%(以FFA釋放量來衡量),脂肪酸凈流出增加了30%。在本研究中,各殼聚糖組蛋種雞血清和肝臟FFA含量不同程度地低于對照組,這可能與LEP有一定關(guān)系?,F(xiàn)有研究結(jié)果顯示,LEP通過抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1和過氧化物酶體增殖劑激活受體γ及其調(diào)控的脂肪生成酶類的活性及mRNA表達(dá)來降低脂質(zhì)生成,通過上調(diào)脂肪分解酶類和脂肪酸氧化酶類的活性來促進(jìn)脂解作用及脂肪酸氧化[15,17-19]。因此,LEP在殼聚糖調(diào)控蛋種雞脂質(zhì)代謝過程中的重要作用及其機(jī)理的研究需要進(jìn)一步深入探討。
① 飼糧添加殼聚糖可降低蛋種雞血清中TG、TC、LDL-C、FFA含量和肝臟FFA含量,增加血清HDL-C含量,改善蛋種雞體內(nèi)脂質(zhì)代謝的健康水平。
② 飼糧添加殼聚糖對蛋種雞血清LEP含量也有一定的降低效果。
③ 飼糧殼聚糖添加水平在652.56~967.18 mg/kg時(shí)對蛋種雞血清TG、LDL-C、VLDL和FFA含量有較好的調(diào)節(jié)效果。
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