錢宏梁 潘志強(qiáng) 王曉敏 盧 濤 方肇勤

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

隨著社會的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人民生活水平不斷提高飲食日益豐富，但過量攝食容易導(dǎo)致代謝類疾??；同樣，攝食不足也將引起機(jī)體代謝異常。兩千多年前的《內(nèi)經(jīng)》強(qiáng)調(diào)“飲食有節(jié)，謹(jǐn)和五味”的思想，已經(jīng)意識到飲食必須有規(guī)律、需節(jié)制，不食或少食不利于健康，暴飲多食也有損健康。大量的文獻(xiàn)報道認(rèn)為肥胖癥、糖尿病、高血壓等許多慢性疾病與飲食有明確的關(guān)系[1-3]，因此，許多健康或亞健康人群有意控制每日飲食量，部分肥胖人群為了減輕體重更是大幅度限制飲食量。然而，控制飲食對機(jī)體是否有損害的報道較少?；陂L期飲食不足容易導(dǎo)致機(jī)體營養(yǎng)失衡、消瘦、虛勞等，以及部分疾病如食管癌、胃癌、厭食癥等因飲食攝入不足，引起機(jī)體代謝異常，也會引發(fā)中醫(yī)類似氣虛證、脾胃虛弱證，甚至陰陽兩虛證等[4]，其中，中醫(yī)氣虛證或脾胃虛弱證與肝臟功能關(guān)系密切，中醫(yī)腎虛證或陰陽兩虛證與腎上腺功能有關(guān)，然而肝臟與腎上腺重要的共性生化特征均是膽固醇代謝的場所。膽固醇在肝臟代謝為膽汁酸，以促進(jìn)脂類的消化吸收與抑制膽固醇在膽汁中析出沉淀，防止結(jié)石形成，有助于闡明中醫(yī)脾胃功能；膽固醇在腎上腺代謝轉(zhuǎn)化為類固醇激素，參與機(jī)體各種應(yīng)激反應(yīng)，涉及中醫(yī)腎藏象的部分功能。因而，探索攝食不足對機(jī)體代謝的影響有助于認(rèn)識中醫(yī)脾腎虛證發(fā)生的可能物質(zhì)基礎(chǔ)，尤其有助于闡明大幅控制飲食對機(jī)體哪些臟器影響最大。本研究以小鼠為試驗對象，通過設(shè)計不同梯度攝食量，比較與尋找導(dǎo)致機(jī)體代謝異常的控食量臨界點(diǎn)以及對臟器影響的強(qiáng)度，并深入研究控食后小鼠膽固醇代謝的異常機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物以及飼料

試驗動物為ICR小鼠，無特定病原(SPF)級，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，30只，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心SPF級動物房，動物許可證號：SCXK(滬)2013-0016，動物合格證編號：2008001672050。

試驗用轉(zhuǎn)基因鼠基礎(chǔ)飼料(貨號1010011)購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.1.2 藥物與試劑

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)營養(yǎng)水平為實(shí)測值。Nutrient levels were measured values.

2)其他包含Others contained the following:天門冬氨酸 Asp 1.74%，蘇氨酸 Thr 1.05%，絲氨酸 Ser 1.06%，谷氨酸 Glu 3.44%；脯氨酸 Pro 1.67%，甘氨酸 Gly 1.32%，丙氨酸 Ala 1.29%；半胱氨酸 Cys 0.36%，纈氨酸 Val 0.94%，蛋氨酸 Met 0.70%，異亮氨酸 Ile 1.18%，亮氨酸 Leu 1.75%；酪氨酸 Tyr 0.76%，苯丙氨酸 Phe 0.92%，賴氨酸 Lys 1.42%，組氨酸 His 0.56%，精氨酸 Arg 1.30%，色氨酸 Trp 0.26%，Cu 16 mg/kg，F(xiàn)e 323 mg/kg，Mg 2.16×103mg/kg，Mn 162 mg/kg，K 7.84×103mg/kg，Na 2.24×103mg/kg，Zn 140 mg/kg，I 1.08 mg/kg，Se 0.37 mg/kg，VA 2.57×104IU/kg，VD34.36×103IU/kg，VE 195 IU/kg，VK320.7 mg/kg，VB185.1 mg/kg，VB218.9 mg/kg，VB6169 mg/kg，煙酸nicotinic acid 88 mg/kg，泛酸 pantothenic acid 3.67×104μg/kg，葉酸 folic acid 5.52×103μg/kg，生物素biotin 388 μg/kg，VB1228.6 ng/kg，膽堿choline 1.84×103mg/kg。

1.1.3 試驗設(shè)備

Eco-illumina實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Illumina公司)、Elx800型酶標(biāo)儀(Biotek公司)、Eppendorf臺式離心機(jī)(5417R型)等。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，當(dāng)體重達(dá)24～25 g后，隨機(jī)分為5組，每組6只，分別是正常對照組(自由攝食)、攝食4.0 g組[攝食量：4.0 g/(只·d)；控食比例：正常攝食量的88%]、攝食3.0 g組[攝食量：3.0 g/(只·d)；控食比例：正常攝食量的66%]、攝食2.0 g組[攝食量：2.0 g/(只·d)；控食比例：正常攝食量的44%]和攝食1.5 g組[攝食量：1.5 g/(只·d)；控食比例：正常攝食量的22%]。試驗開始后，正常對照組給予100 g飼糧，置于籠具飼糧投放位置，令其自由攝食，24 h后稱量剩余的飼糧量，然后再補(bǔ)充至100 g；4個控食組則精確稱量設(shè)定的24 h攝食量的飼糧，分別為24、18、12、9 g，置于籠具飼糧投放位置，并于24 h后再補(bǔ)充飼糧(補(bǔ)充飼量時，各控食組前1天飼糧均被攝取完)；每日重復(fù)上述飼喂方式，共進(jìn)行14 d。試驗過程中小鼠自由飲水，每隔1 d稱量體重，并觀察記錄小鼠精神狀態(tài)等信息。

1.2.2 樣品采集

在第15天處死各組小鼠，取材方法如下：1)摘眼球取血，分離血清，-20 ℃保存，用于皮質(zhì)酮含量檢測；2)分別摘取心臟、胸腺、肝臟、脾臟、腎臟(雙側(cè))、睪丸(雙側(cè))稱重(以g表示)，并計算臟器指數(shù)，以臟器質(zhì)量(g)與體重(g)的比值表示；3)取腎上腺，抽提總RNA，檢測β-actin、StAR、細(xì)胞色素P450家族成員11A1(Cyp11a1)、細(xì)胞色素P450家族成員21A1(Cyp21a1)、細(xì)胞色素P450家族成員11B1(Cyp11b1)、細(xì)胞色素P450家族成員11B2(Cyp11b2)等基因mRNA相對表達(dá)量；4)抽提腎上腺總蛋白，檢測StAR蛋白相對表達(dá)量；5)取肝臟，抽提總RNA，檢測β-actin、載脂蛋白A1(Apoa1)、載脂蛋白E(Apoe)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(Abca1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(Abcg1)、細(xì)胞色素P450家族成員7A1(Cyp7a1)、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(Hmgcr)、低密度脂蛋白受體(Ldlr)、肝臟X受體α(Nr1h3或LXRα)、肝臟X受體β(Nr1h2或LXRβ)、過氧化物酶體增殖劑激活受體α(Ppara或PPARα)、過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(Pparg或PPARγ)、B類清道夫受體1(Scarb1或SRB1)、固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白1(Srebf1或SREBP1)、固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白2(Srebf2或SREBP2)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶1(Hmgcs1)、酯酰輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(Acat1)、激素敏感脂酶(Lipe)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G5(Abcg5)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G8(Abcg8)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(Scap)、胰島素誘導(dǎo)基因1(Insig1)、胰島素誘導(dǎo)基因2(Insig2)等膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測基因mRNA表達(dá)量

上、下游引物序列采用Primer 3(v.0.4.0)在線軟件合成，委托Life Technologies公司上海合成部完成，詳見表2和表3。按照Trizol試劑盒說明書抽提肝臟與腎上腺總RNA；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)程序為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序為95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。目的基因mRNA相對表達(dá)量分析方法：以正常對照組作為空白對照，以β-actin基因Ct均值作為內(nèi)參對照，采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量：

△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因； △△Ct=△Ct控食組-△Ct正常對照組； 目的基因mRNA相對表達(dá)量=2-△△Ct。

式中：Ct為擴(kuò)增n個循環(huán)基因的熒光數(shù)值。

1.2.4 Western blot檢測StAR蛋白相對表達(dá)量

采用RIPA裂解液處理組織，收集總蛋白樣品并予以定量，通過變性處理，依次執(zhí)行聚丙烯凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再洗滌、顯影等流程，其中，一抗內(nèi)參β-actin以1∶20 000稀釋、StAR抗體以1∶2 000稀釋。以β-actin作為內(nèi)參，分析StAR蛋白相對表達(dá)量。

1.2.5 ELISA檢測血清皮質(zhì)酮含量

使用試驗小鼠血清原液，依據(jù)小鼠皮質(zhì)酮ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測血清皮質(zhì)酮含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用graphPad.Prism5.0專業(yè)軟件進(jìn)行作圖及統(tǒng)計分析，其中，體重分析采用重復(fù)測量(repeated measurement)方法統(tǒng)計，僅分析各控食組與正常對照組的差異；各臟器質(zhì)量及其臟器指數(shù)均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計分析，

P<0.05表示差異在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性意義。

表2 肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因引物序列

續(xù)表2基因名稱Gene nameGenBank登錄號GenBank accession No.引物序列Primer sequences產(chǎn)物長度Product length/bpSrebf1NM_001313979上游:5'-GATCAAAGAGGAGCCAGTGC-3'下游:5'-TAGATGGTGGCTGCTGAGTG-3'191Srebf2NM_033218 上游:5'-GGATCCTCCCAAAGAAGGAG-3'下游:5'-TTCCTCAGAACGCCAGACTT-3'147

β-actin：β-肌動蛋白；Abca1：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1 ATP-binding cassette transporter A1；Abcg1：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1 ATP-binding cassette transporter G1；Abcg5：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G5 ATP-binding cassette transporter G5；Abcg8：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G8 ATP-binding cassette transporter G8；Acat1：酯酰輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1 acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferases 1；Apoa1：載脂蛋白A1 apolipoprotein A1；Apoe：載脂蛋白E apolipoprotein E；Cyp7a1：細(xì)胞色素P450家族成員7A1 cytochromes P450 7A1；Hmgcr：羥甲基戊二酰輔酶A還原酶 hydroxymethyl glutaric acyl coenzyme A reductase；Hmgcs1：3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶1 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase 1；Insig1：胰島素誘導(dǎo)基因1 insulin induced gene 1；Insig2：胰島素誘導(dǎo)基因2 insulin induced gene 2；Ldlr：低密度脂蛋白受體 low-density lipoprotein receptor；Lipe：激素敏感脂酶 hormone-sensitive triglayceride lipase；Nr1h3：肝臟X受體α liver X receptor α；Nr1h2：肝臟X受體β liver X receptor β；Ppara：過氧化物酶體增殖劑激活受體α peroxisome proliferators-activated receptor α；Pparg：過氧化物酶體增殖劑激活受體γ peroxisome proliferators-activated receptor γ；Scap：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白 sterol regulatory element binding protein cleavage active protein；Scarb1：B類清道夫受體1 scavenger receptor class B member 1；Srebf1：固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白1 sterol regulatory element binding protein 1；Srebf2：固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白2 sterol regulatory element binding protein 2。表5至表10同 The same as Table 5 to Table 10。

表3 腎上腺膽固醇代謝相關(guān)基因引物序列

β-actin：β-肌動蛋白；Cyp11a1：細(xì)胞色素P450家族成員11A1 cytochromes P450 11A1；Cyp11b1：細(xì)胞色素P450家族成員11B1 cytochromes P450 11B1；Cyp11b2：細(xì)胞色素P450家族成員11B2 cytochromes P450 11B2；Cyp21a1：細(xì)胞色素P450家族成員21A1 cytochromes P45021A1；StAR：類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白 steroidogenic acute regulatory protein。表11同 The same as Table 11。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠體重動態(tài)變化

正常對照組小鼠體重緩慢增長，至第15天體重增長至30 g。與正常對照組比較，在各個時間點(diǎn)攝食4.0 g組小鼠體重均略下降，但差異均不顯著(P>0.05)；然而，從第5天起，攝食3.0 g組、攝食2.0 g組和攝食1.5 g組小鼠體重顯著下降(P<0.05)，且體重下降與攝食量有一定相關(guān)性。結(jié)果提示，3.0 g/(只·d)甚至更低的攝食量將引起小鼠體重的下降。

數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注“*”表示與正常對照組相比差異顯著(P<0.05)。

Date points with “*” indicated significant difference compared with normal control group (P<0.05).

圖1各組小鼠體重變化比較

Fig.1 Comparison of body weight change of mice among groups

2.2 小鼠臟器質(zhì)量與臟器指數(shù)變化

2.2.1 心臟質(zhì)量與心臟指數(shù)變化

由表4可知，與正常對照組比較，各控食組小鼠心臟質(zhì)量顯著下降(P<0.05、P<0.01或P<0.001)，且隨攝食量的降低逐漸降低；然而，各控食組小鼠心臟指數(shù)均無顯著變化(P>0.05)，提示控食后小鼠心臟質(zhì)量隨體重同步下降。

2.2.2 肝臟質(zhì)量與肝臟指數(shù)變化

由表4可知，與正常對照組比較，各控食組小鼠肝臟質(zhì)量顯著下降(P<0.05)，尤其以攝食量在3.0 g/(只·d)及以下的各組最顯著(P<0.001)，此時且肝臟指數(shù)也顯著下降(P<0.001)，提示控食后小鼠肝臟萎縮最明顯，可能與肝臟是機(jī)體重要的代謝器官有關(guān)。

2.2.3 腎臟質(zhì)量與腎臟指數(shù)變化

由表4可知，與正常對照組比較，各控食組小鼠腎臟質(zhì)量顯著下降(P<0.05或P<0.001)，尤其以攝食量在3.0 g/(只·d)及以下的各組最顯著(P<0.001)，且攝食3.0 g組、攝食2.0 g組小鼠腎臟指數(shù)也顯著下降(P<0.05)，提示控食后小鼠腎臟也明顯萎縮。

2.2.4 脾臟質(zhì)量與脾臟指數(shù)變化

由表4可知，與正常對照組比較，攝食量在3.0 g/(只·d)及以下的各組小鼠脾臟質(zhì)量顯著下降(P<0.001)，且脾臟指數(shù)也有所下降，其中攝食2.0 g組降低顯著(P<0.05)，提示攝食量在3.0 g/(只·d)及以下的小鼠脾臟明顯萎縮且相比體重萎縮更明顯。

2.2.5 胸腺質(zhì)量與胸腺指數(shù)變化

由表4可知，與正常對照組比較，攝食量在3.0 g/(只·d)及以下的各組小鼠胸腺質(zhì)量顯著下降(P<0.01或P<0.001)，且胸腺指數(shù)也有所下降，其中攝食1.5 g組降低顯著(P<0.05)，提示攝食量在3.0 g/(只·d)及以下的小鼠胸腺與脾臟類似，也出現(xiàn)明顯萎縮，其免疫功能下降。

2.2.6 睪丸質(zhì)量與睪丸指數(shù)變化

由表4可知，與正常對照組比較，各控食組小鼠睪丸質(zhì)量下降不顯著(P>0.05)，且攝食2.0 g組和攝食1.5 g組的睪丸指數(shù)還顯著升高(P<0.01或P<0.001)，這說明相對體重變化而言，小鼠睪丸沒有明顯萎縮情況，同時還因小鼠體重下降導(dǎo)致睪丸指數(shù)相對升高，提示控食對小鼠睪丸無明顯影響。

總之，嚴(yán)格控制攝食對機(jī)體免疫器官脾臟與胸腺的影響最大，其次是代謝器官肝臟與腎臟，而對睪丸的影響最小。

2.3 肝臟膽固醇代謝不同過程相關(guān)基因表達(dá)變化

2.3.1 膽固醇攝取過程

由表5可知，與正常對照組比較，攝食量在3.0 g/(只·d)及以下的各組Ldlr和Scarb1基因的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。由于低密度脂蛋白受體(LDLR，其基因名為Ldlr)和B類清道夫受體1(SRB1，其基因名為Scarb1)是肝臟細(xì)胞攝入膽固醇的重要受體，此結(jié)果提示，嚴(yán)格控制攝食后，吸收入血液中的膽固醇含量下降，小鼠肝細(xì)胞Ldlr基因的表達(dá)代償性上調(diào)，以促進(jìn)肝細(xì)胞攝入血液膽固醇。

2.3.2 膽固醇合成過程

由表6可知，與正常對照組比較，攝食量在3.0 g/(只·d)及以下的各組Hmgcr基因的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，而Hmgcs1基因的表達(dá)無顯著變化(P>0.05)。由于羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR，其基因名為Hmgcr)參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇的自身合成過程，此結(jié)果提示，控制攝食后，小鼠肝細(xì)胞通過促進(jìn)Hmgcr基因表達(dá)上調(diào)，以促進(jìn)肝細(xì)胞合成膽固醇。

表4 小鼠臟器質(zhì)量及臟器指數(shù)變化

“*”、“**”、“***”均表示與正常對照組相比差異顯著，但它們的P值分別為<0.05、<0.01、<0.001。下表同。

“*”, “**” and “***” all indicated significant difference compared with normal control group, but theP-values of them were <0.05, <0.01 and <0.001, respectively. The same as below.

表5 肝臟膽固醇攝取過程相關(guān)基因表達(dá)變化

表6 肝臟膽固醇合成過程相關(guān)基因表達(dá)變化

2.3.3 膽固醇儲存過程

由表7可知，與正常對照組比較，攝食3.0 g組和攝食2.0 g組Lipe基因的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，而促進(jìn)酯化的Acat1基因的表達(dá)無顯著變化(P>0.05)。這提示，控制攝食后，小鼠肝細(xì)胞通過上調(diào)Lipe基因表達(dá)，以促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴內(nèi)酯化的膽固醇轉(zhuǎn)化為游離膽固醇，供細(xì)胞所需以彌補(bǔ)膽固醇攝入不足。

表7 肝臟膽固醇儲存過程相關(guān)基因表達(dá)變化

2.3.4 膽固醇流出過程

由表8可知，與正常對照組比較，攝食4.0 g組Apoe、Abcg5和Abcg8基因的表達(dá)并沒有顯著變化(P>0.05)，然而，攝食量在3.0 g/(只·d)及以下的各組上述基因的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)，同時各控食組Apoa1、Abca1和Abcg1基因的表達(dá)均無顯著變化(P>0.05)。這提示，嚴(yán)格控食后小鼠肝臟膽固醇流出增加，體現(xiàn)肝細(xì)胞代謝活躍。

表8 肝臟膽固醇流出過程相關(guān)基因表達(dá)變化

2.3.5 膽固醇代謝轉(zhuǎn)化過程

由表9可知，與正常對照組比較，除攝食4.0 g組Cyp7a1基因的表達(dá)無顯著變化(P>0.05)外，其他控食組小鼠肝臟Cyp7a1和Scap基因的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。這提示，控食后加快了小鼠肝臟膽固醇代謝為膽汁酸的過程。

表9 肝臟膽固醇代謝轉(zhuǎn)化過程相關(guān)基因表達(dá)變化

2.3.6 膽固醇穩(wěn)態(tài)

由表10可知，與正常對照組比較，攝食量在3.0 g/(只·d)及以下的各組Nr1h2、Ppara、Pparg基因的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)，Insig2基因的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，而各組Nr1h3、Srebf1、Srebf2和Insig1基因的表達(dá)則無顯著變化(P>0.05)。這提示，控制攝食后小鼠調(diào)節(jié)肝臟膽固醇合成與代謝的肝臟X受體β(LXRβ，基因符號為Nr1h2)、過氧化物酶體增殖劑激活受體α(PPARα，基因符號為Ppara)、過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ，基因符號為Pparg)被激活，以調(diào)節(jié)膽固醇的穩(wěn)態(tài)平衡。

表10 肝臟膽固醇穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因表達(dá)變化

綜合上述結(jié)果可知，控制攝食尤其是大比例限食后對小鼠肝臟膽固醇合成和代謝類基因的表達(dá)具有一定的影響，同時小鼠肝臟細(xì)胞也具有自我糾正細(xì)胞內(nèi)外膽固醇穩(wěn)態(tài)平衡的功能。

2.4 腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)激素過程重要基因表達(dá)變化

由表11可知，與正常對照組比較，攝食2.0 g組和攝食1.5 g組Cyp11a1、Cyp21a1基因的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)，攝食1.5 g組StAR和Cyp11b1基因的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)，且攝食3.0 g組、攝食2.0 g組和攝食1.5 g組Cyp11b2基因的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。由于StAR和Cyp11a1是腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮的關(guān)鍵限速酶，Cyp21a1和Cyp11b1是皮質(zhì)激素合成的方向酶，這提示，嚴(yán)格控制攝食后小鼠腎上腺可增強(qiáng)膽固醇的轉(zhuǎn)化用于合成皮質(zhì)激素以適應(yīng)外界的應(yīng)激反應(yīng)；而Cyp11b2是醛固酮合成的關(guān)鍵酶，Cyp11b2基因表達(dá)下調(diào)提示小鼠嚴(yán)格控食后水鈉代謝失衡。

2.5 腎上腺StAR蛋白表達(dá)變化

由圖2可知，與正常對照組比較，各控食組小鼠腎上腺StAR蛋白表達(dá)均增強(qiáng)且與控食程度有關(guān)，隨著攝食量的降低而增強(qiáng)，提示控食后小鼠腎上腺StAR蛋白呈現(xiàn)代償性表達(dá)，以促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化合成類固醇激素。

2.6 控食對小鼠血清皮質(zhì)酮分泌的影響

由圖3可知，與正常對照組比較，攝食4.0 g組、攝食3.0 g組小鼠血清皮質(zhì)酮含量略有下降，而攝食1.5 g組小鼠血清皮質(zhì)酮含量幾乎無變化，各控食組與正常對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 控制攝食對小鼠體重、主要臟器的影響

食物是哺乳動物機(jī)體最基本的需求，長期的攝食不足必將引起機(jī)體代謝異常，導(dǎo)致消瘦甚至惡液質(zhì)樣變化。早在《內(nèi)經(jīng)》就有“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)入道，下輸膀胱。水精四布，五經(jīng)并行。合于四時五臟陰陽，揆度以為常也(《素問·經(jīng)脈別論》)?！钡拿枋鯷5]，體現(xiàn)了祖國醫(yī)學(xué)對飲食入胃后其精氣復(fù)雜的轉(zhuǎn)化與傳輸過程的認(rèn)識和高度總括。由此可見，由于飲食攝入不足必將影響機(jī)體臟腑功能的正常發(fā)揮，在臨床上一些患者因控制飲食致厭食或被動不能進(jìn)食，日久消瘦，機(jī)體出現(xiàn)明顯的代謝異常表現(xiàn)。從治療學(xué)角度考慮，補(bǔ)充攝食量足以糾正機(jī)體代謝失常，然而，攝食量減少后機(jī)體代謝發(fā)生哪些異常、控制攝食量比例多少對機(jī)體代謝影響最小，這是研究者所關(guān)心的問題。在一定比例之內(nèi)的控制攝食對身體各項功能有許多正面作用，陳國芳等[6]報道控制攝食改善代謝指標(biāo)的分子機(jī)制涉及多個方面。首先，控制攝食過程中體內(nèi)酮體水平增加，適度升高的β-羥丁酸能夠通過增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激因子叉頭蛋白O3A(FOXO3A)和金屬硫蛋白2(MT2)的活性，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害。其次，控制攝食后體內(nèi)的瘦素水平降低，瘦素抵抗得到改善；同時，胰島素樣生長因子1(IGF-1)的水平下降，而IGF-1/胰島素信號通路下調(diào)與控制攝食的抗衰老、抗腫瘤、延長壽命作用密切相關(guān)。

表11 腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)激素過程重要基因表達(dá)變化

1：正常對照組 normal control group；2：攝食4.0 g組 4.0 g feeding group；3：攝食3.0 g組 3.0 g feeding group；4：攝食2.0 g組 2.0 g feeding group；5：攝食1.5 g組 1.5 g feeding group。

圖2各組小鼠腎上腺StAR蛋白表達(dá)比較

Fig.2 Comparison of StAR protein expression in adrenal gland of mice among groups

本試驗結(jié)果表明，對于體重約25 g的ICR雄性小鼠，正常對照組小鼠24 h自由攝食量通常為4～5 g，平均約為4.5 g(攝食量約占體重的18%)，按照正常攝食量的88%[4.0 g/(只·d)，攝食量約占體重的16%]給食后，小鼠體重及其臟器輕度縮??；按照正常攝食量的66%[3.0 g/(只·d)，攝食量約占體重12%]給食后，小鼠體重、心臟、肝臟、腎臟、脾臟及胸腺均明顯萎縮；而按照正常攝食量的44%[2.0 g/(只·d)，攝食量約占體重8%]及33%[1.5 g/(只·d)，攝食量約占體重的6%]給食后，小鼠體重及其臟器萎縮更加明顯。該結(jié)果提示，2/3的正常攝食量可能是一個重要的臨界點(diǎn)，一旦控食比例超過正常攝食量2/3以上，首要損害的是脾臟、胸腺與肝臟，其次是心臟和腎臟，而對性腺組織睪丸的影響最小。謝德娟[7]研究發(fā)現(xiàn)，高營養(yǎng)可提高雄果蠅的精子束數(shù)量，加強(qiáng)生殖細(xì)胞的分裂，增加精巢的體積，進(jìn)而提高雄果蠅的生殖能力，而限食則與其相反，導(dǎo)致雄果蠅生殖能力降低，但兩者在老齡時都加速了生殖系統(tǒng)衰老狀態(tài)的產(chǎn)生；此外，限食可通過降低雄果蠅的生殖能力而延長壽命，高營養(yǎng)則增強(qiáng)了雄果蠅的生殖能力從而使壽命降低，提示了生存與生殖間存在著物質(zhì)、能量分配與平衡。從本次試驗發(fā)現(xiàn)各控食組小鼠的日常活躍度明顯高于正常對照組小鼠，生殖器官的質(zhì)量沒有明顯下降，提示生殖功能不受控制攝食的影響。

3.2 控制攝食對小鼠肝臟膽固醇代謝的影響

膽固醇又稱膽甾醇，廣泛存在于動物體內(nèi)，膽固醇在動物體內(nèi)代謝情況對生物機(jī)體的生長、生殖各方面有重要生物學(xué)意義。膽固醇攝入的不足和過度都會影響生物機(jī)體的正?；顒?，本試驗結(jié)果表明，按照正常攝食量66%以上比例[1.5～3.0 g/(只·d)]給食后，小鼠肝臟Ldlr、Scarb1、Hmgcr、Lipe、Apoe、Abcg5、Abcg8、Cyp7a1、Scap、Nr1h2、Ppara、Pparg基因的表達(dá)均顯著上調(diào)，而Insig2基因的表達(dá)則顯著下調(diào)，提示控食比例超過正常攝食量2/3以上時，涉及肝臟膽固醇攝取、合成、儲存、流出、代謝以及調(diào)控膽固醇穩(wěn)態(tài)的基因出現(xiàn)異常表達(dá)。研究表明，LDLR主要介導(dǎo)細(xì)胞對低密度脂蛋白的攝取與代謝過程，通過清除血液循環(huán)的中密度脂蛋白，降低低密度脂蛋白生成，并介導(dǎo)細(xì)胞攝取低密度脂蛋白，以加速其降解，從而維持血漿低密度脂蛋白相對穩(wěn)定，如果LDLR功能異常將導(dǎo)致體內(nèi)脂代謝紊亂[8]。SRB1是目前唯一被確認(rèn)的高密度脂蛋白受體，主要分布于肝臟，它既能與高密度脂蛋白結(jié)合，還能與天然的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白及乙?；兔芏戎鞍椎冉Y(jié)合，主要參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，清除外周組織過多的膽固醇，以減緩脂質(zhì)的沉積，被認(rèn)為是一種抗動脈粥樣硬化分子[9]。HMGCR是催化細(xì)胞內(nèi)膽固醇從頭合成的限速酶，是調(diào)控膽固醇代謝的關(guān)鍵酶[10]。本研究結(jié)果提示，大幅度控制攝食后小鼠肝臟參與膽固醇攝取、合成及膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的生化過程活躍，導(dǎo)致循環(huán)血液中膽固醇的含量下降。

圖3 各組小鼠血清皮質(zhì)酮含量比較Fig.3 Comparison of serum corticosterone content of mice among groups

此外，膽固醇7α羥化酶(由Cyp7a1基因編碼)是肝臟膽固醇代謝為膽汁酸的第1步限速酶，并受成纖維細(xì)胞生長因子15(FgF15)等分子調(diào)控[11]。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)家族成員ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ABCG5，其基因名為Abcg5)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G8(ABCG8，其基因名為Abcg8)能夠抑制小腸對膽固醇的吸收，增加膽固醇的膽汁分泌，在膽固醇的吸收和膽汁分泌等方面發(fā)揮重要作用[12-13]。而ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1，其基因名為Abca1)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ABCG1，其基因名為Abcg1)主要功能是參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程[14]。核內(nèi)受體超家族是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子[15-16]，其中肝臟X受體α(LXRα，基因名為Nr1h3)、LXRβ、過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)等均可通過調(diào)節(jié)Ldlr、Scarb1基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)膽固醇的代謝，PPARα是臨床上常用的貝特類藥物的靶點(diǎn)，而PPARγ參與控制葡萄糖和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，是Ⅱ型糖尿病藥物作用的重要靶點(diǎn)，因此，LXRα、LXRβ、PPARα和PPARγ被認(rèn)為是調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子。據(jù)Jakulj等[12]研究結(jié)果提示，大幅度控制攝食后小鼠肝臟通過上調(diào)Abcg5和Abcg8基因的表達(dá)以抑制小腸膽固醇的吸收，并通過上調(diào)Cyp7a1基因的表達(dá)加速膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸代謝過程，同時通過上調(diào)Nr1h2和Ppara、Pparg基因的表達(dá)主動參與調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)平衡。

3.3 控制攝食對小鼠腎上腺膽固醇轉(zhuǎn)化的影響

腎上腺是將膽固醇轉(zhuǎn)化為類固醇激素的重要代謝器官，尤其是腎上腺糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，參與生命體重要的細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)過程，而皮質(zhì)激素合成酶在此過程發(fā)揮重要的生化作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，按照正常攝食量44%及以上比例[1.5～2.0 g/(只·d)]給食后，小鼠腎上腺參與編碼膽固醇側(cè)鏈裂解酶的Cyp11a1基因和皮質(zhì)激素合成方向酶的基因Cyp21a1的表達(dá)均顯著上調(diào)，提示嚴(yán)格控制攝食后小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞利用膽固醇轉(zhuǎn)化代謝為皮質(zhì)激素的生化過程處于十分活躍狀態(tài)；此外，按照正常攝食量的33%[1.5 g/(只·d)]更嚴(yán)格控制攝食后，StAR基因與StAR蛋白以及編碼皮質(zhì)酮合成酶11β羥化酶1的基因Cyp11b1的表達(dá)均顯著上調(diào)，而編碼醛固酮合成酶11β羥化酶2的基因Cyp11b2的表達(dá)顯著下降，提示大幅度嚴(yán)格控制攝食后小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過程主動增強(qiáng)，以提供更多的游離膽固醇供線粒體合成類固醇所需，且皮質(zhì)酮合成過程更活躍，但是醛固酮合成過程被抑制。然而，值得注意的是，僅發(fā)現(xiàn)按照正常攝食量88%和66%給食的小鼠血清皮質(zhì)酮含量略下降，并沒有呈現(xiàn)與皮質(zhì)酮合成酶的基因與蛋白表達(dá)一致性的趨勢，推測皮質(zhì)酮合成過程可能因被動性代償而基因表達(dá)活躍而皮質(zhì)酮分泌入血液中的實(shí)際含量依然不足，甚至與皮質(zhì)酮代謝到尿液過程加速有關(guān)。

4 結(jié) 論

① 超過正常攝食量1/3以上的控食比例將影響ICR小鼠體重及其臟器，首要損害的是脾臟、胸腺與肝臟，其次是心臟和腎臟，而對性腺組織睪丸影響最小，提示嚴(yán)格控制攝食最先損及免疫和代謝器官，而生殖器官自我保護(hù)能力最強(qiáng)，從而不影響繁衍后代。

② 大比例嚴(yán)格控制攝食后，小鼠肝臟參與膽固醇攝取、合成與代謝關(guān)鍵基因表達(dá)活躍，以維持肝細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)平衡的基本生物學(xué)機(jī)制。

③ 嚴(yán)格控制攝食后，膽固醇在腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為類固醇激素生化過程活躍，以主動合成皮質(zhì)激素適應(yīng)外界不同應(yīng)激。

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