李 娜 靳慧杰 賈漫麗 黃 露 謝 巖 夏愛華 楊貴明 李季生*

(1.河北省高校特產(chǎn)蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所，承德 067000； 3.河北省正定農(nóng)業(yè)綜合技術(shù)推廣站，石家莊 050800)

尿酸是嘌呤代謝的終產(chǎn)物，人體尿酸來源主要有2條途徑，一是內(nèi)源性的，是由體內(nèi)核蛋白分解代謝產(chǎn)生，約占總量的80%；二是外源性的，是由攝入的富含嘌呤的食物分解代謝而產(chǎn)生。而尿酸的排泄主要經(jīng)過腸道(1/3)和腎臟(2/3)排泄。當(dāng)尿酸的產(chǎn)生或排泄失常時(shí)，導(dǎo)致血液中尿酸含量男性>488 mol/L、女性>387 mol/L，稱為高尿酸血癥[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白質(zhì)飲食很有可能加劇體內(nèi)嘌呤代謝的壓力，從而誘發(fā)嘌呤代謝的紊亂。大量的醫(yī)學(xué)研究表明，食用過量的脂肪和蛋白質(zhì)使得人類罹患高尿酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步加大，以高尿酸血癥和尿酸鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)腔及軟組織而引起痛風(fēng)[5-7]。另外，尿酸可以促進(jìn)血小板聚集，進(jìn)而誘發(fā)血栓形成[8]。因此，痛風(fēng)和糖尿病一樣也是危害人類健康的一種嚴(yán)重的代謝性疾病[9-10]。

酵母浸粉(yeast extract powder,YEP)含有豐富的蛋白質(zhì)、核苷酸、B族維生素等，在體內(nèi)充分水解能產(chǎn)生含氮的有機(jī)堿(包括嘌呤堿類、嘧啶堿類)和磷酸。大劑量的酵母進(jìn)入體內(nèi)后能干擾機(jī)體正常的嘌呤代謝，致嘌呤代謝紊亂，其主要表現(xiàn)為XOD活性升高，尿酸生成加速。在醫(yī)學(xué)研究中，普遍采用小鼠或大鼠作為高尿酸血癥造模的材料，通過添食酵母膏[11-12]、酵母浸粉[13-14]等造模劑均可以很好地建立高尿酸血癥模型。

家蠶是鱗翅目昆蟲第二大模式生物，是研究動(dòng)物生理生化、遺傳學(xué)和基因組學(xué)不可多得的寶貴資源[15-16]。家蠶生物信息資源豐富[17-18]，研究平臺(tái)完善，很多生理學(xué)特性與人接近，為家蠶成為研究人類生理、疾病、遺傳和開發(fā)新型藥物的優(yōu)良模式動(dòng)物奠定了良好的基礎(chǔ)[19-24]。而在尿酸的代謝方面，Tamura等[25]發(fā)現(xiàn)注射黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase,XDH)可導(dǎo)致油蠶的排泄物中尿酸含量增加，表皮由半透明逐漸變成白色不透明。由此可見，家蠶體壁顏色的變化可以直觀地反映尿酸代謝，為以家蠶為模型研究尿酸代謝提供了更加有利的條件。張曉麗[26]、王長(zhǎng)春[27]通過給家蠶口服痛風(fēng)治療藥物別嘌醇或非布索坦后發(fā)現(xiàn)這些藥物可有效降低家蠶體內(nèi)XOD活性和血淋巴、脂肪體內(nèi)的尿酸含量，且與臨床效果基本一致，均認(rèn)為家蠶可以作為動(dòng)物模型替代小鼠用于篩選和評(píng)價(jià)抗痛風(fēng)藥物療效。然而，這些研究只是集中在現(xiàn)有藥物對(duì)家蠶尿酸代謝的影響方面，而酵母浸粉對(duì)家蠶尿酸代謝的影響及如何誘導(dǎo)家蠶成為高尿酸血癥模型涉及較少。血液中尿酸含量和甘油三酯含量是2個(gè)常用的生化檢測(cè)項(xiàng)目，甘油三酯代謝異常是代謝綜合征的重要表現(xiàn)形式，而高尿酸血癥是代謝綜合征常常伴有的代謝異?，F(xiàn)象，二者具有明顯的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)為0.64)[28-30]。鑒于此，本試驗(yàn)以不同濃度的酵母浸粉涂抹桑葉后飼喂家蠶，通過對(duì)家蠶的體重增長(zhǎng)率以及血淋巴中尿酸含量、XOD活性和甘油三酯含量等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，來評(píng)價(jià)酵母浸粉對(duì)家蠶尿酸代謝的影響，旨在為建立家蠶高尿酸血癥模型提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試家蠶和主要試劑

供試家蠶品種為“菁松×皓月”，由承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所家蠶研究室選育保存；主要試劑尿酸檢測(cè)試劑盒、XOD檢測(cè)試劑盒以及甘油三酯檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；酵母浸粉購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼喂方法

試驗(yàn)采用新鮮桑葉，按照標(biāo)準(zhǔn)飼育規(guī)程飼養(yǎng)到5齡起蠶后，挑選大小一致、發(fā)育整齊的家蠶600頭，隨機(jī)分成4個(gè)組，分別記為對(duì)照組、JM1組、JM2組、JM3組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50頭，雌雄各占1/2。根據(jù)前期初步試驗(yàn)結(jié)果，家蠶對(duì)酵母浸粉存在一定的拒食性。因此，用千分之一天平稱取一定質(zhì)量的酵母浸粉溶解到相應(yīng)體積的蒸餾水中，分別配制成質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%(JM1組)、2%(JM2組)和4%(JM3組)的酵母浸粉溶液，用以涂抹桑葉，對(duì)照組則用蒸餾水替代。每組每天定量(20 mL)均勻涂抹60 g桑葉，待家蠶吃完涂抹有酵母浸粉的桑葉后，讓其充分取食新鮮桑葉。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 樣品采集

分別在添食3、4、5 d后，每個(gè)重復(fù)各選取6頭家蠶(雌雄各占1/2)，剪去尾角，輕壓腹部采集血淋巴于冰浴的離心管中，加入少量苯基硫脲后置于-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定及方法

體重增長(zhǎng)率測(cè)定：采用千分之一天平稱量每組家蠶在試驗(yàn)開始和試驗(yàn)第5天時(shí)的總重，得出平均初始體重和平均終末體重，從而計(jì)算體重增長(zhǎng)率。

體重增長(zhǎng)率=100×(平均終末體重- 平均初始體重)/平均初始體重。

血淋巴中甘油三酯含量按照試劑盒說明采用BioTek酶標(biāo)儀通過比色法進(jìn)行測(cè)定，波長(zhǎng)為510 nm；血淋巴中尿酸含量和XOD活性均按照試劑盒說明采用T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，波長(zhǎng)分別為690和530 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)組間差異進(jìn)行Duncan氏法多重比較及Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05表示差異顯著，以P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母浸粉對(duì)家蠶體重增長(zhǎng)率的影響

圖1顯示了家蠶添食不同濃度酵母浸粉5 d后體重增長(zhǎng)率的變化。從圖中可以看出，添食不同濃度的酵母浸粉可不同程度地影響家蠶生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，添食1%、2%、4%酵母浸粉的家蠶體重增長(zhǎng)率均顯著升高(P<0.05)；各添食酵母浸粉組之間差異不顯著(P>0.05)，但隨著酵母浸粉濃度的升高，體重增長(zhǎng)率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。下圖同。

Data columns with different letters indicates significant difference (P<0.05), while with the same letter indicates no significant difference (P>0.05). The error line indicates the standard error of the mean. The same as below.

圖1家蠶添食不同濃度酵母浸粉5d后體重增長(zhǎng)率的變化

Fig.1 Body weight growth rate change of silkworms fed YEP with different concentrations for 5 days

2.2 酵母浸粉對(duì)家蠶血淋巴中甘油三酯含量的影響

圖2顯示了家蠶添食不同濃度酵母浸粉5 d后血淋巴中甘油三酯含量的變化。從圖中可以看出，隨著酵母浸粉濃度的升高，家蠶血淋巴中甘油三酯含量下降，但各試驗(yàn)組均高于對(duì)照組(1.42～1.98倍于對(duì)照組)。其中，添食1%和2%酵母浸粉的家蠶血淋巴中甘油三酯含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但添食4%酵母浸粉的家蠶血淋巴中甘油三酯含量則與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

圖2 家蠶添食不同濃度酵母浸粉5 d后血淋巴中甘油三酯含量的變化Fig.2 Change of triglyceride content in haemolymph of silkworms fed YEP with different concentrations for 5 days

2.3 酵母浸粉對(duì)家蠶血淋巴中尿酸含量的影響

圖3顯示了家蠶添食不同濃度酵母浸粉3～5 d后血淋巴中尿酸含量的變化。從圖中可以看出，添食不同濃度的酵母浸粉后，家蠶血淋巴中尿酸的含量有了不同程度的變化。隨著添食時(shí)間的延長(zhǎng)，各組家蠶血淋巴中尿酸的含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，第5天與第3天相比差異均達(dá)到了顯著水平(P<0.05)；隨著酵母浸粉濃度的升高，各時(shí)間點(diǎn)家蠶血淋巴中尿酸含量均呈現(xiàn)規(guī)律性的升高，但各試驗(yàn)組與對(duì)照組的差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

圖3 家蠶添食不同濃度酵母浸粉3～5 d后血淋巴中尿酸含量的變化Fig.3 Change of uric acid content in haemolymph of silkworms fed supplementary YEP with different concentrations for 3 to 5 days

2.4 酵母浸粉對(duì)家蠶血淋巴中XOD活性的影響

圖4顯示了家蠶添食不同濃度酵母浸粉3～5 d后血淋巴中XOD活性的變化。從圖中可以看出，隨著添食時(shí)間的延長(zhǎng)，家蠶血淋巴中XOD活性在不同組間變化不同，但各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間差異均不顯著(P>0.05)。各組第4天血淋巴中XOD活性相比第3天均有一定的升高，但是到第5天時(shí)，JM1組和JM2組相比第4天有不同程度的下降。在各時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，3個(gè)試驗(yàn)組血淋巴中XOD活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但是，第3天與第4天家蠶血淋巴中XOD活性隨著酵母浸粉濃度的升高均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。

圖4 家蠶添食不同濃度酵母浸粉3～5 d后血淋巴中XOD活性的變化Fig.4 Change of XOD activity in haemolymph of silkworms fed YEP with different concentrations for 3 to 5 days

2.5 家蠶血淋巴中尿酸含量與XOD活性、甘油三酯含量的相關(guān)性

表1可以看出，家蠶添食不同濃度酵母浸粉3～5 d后，在第3天、第4天，血淋巴中尿酸含量與XOD活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；在第5天，血淋巴中尿酸含量與XOD活性和甘油三酯含量均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

3 討 論

3.1 影響酵母浸粉改變家蠶血淋巴中尿酸含量的因素分析

從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，添食酵母浸粉可以引起家蠶血淋巴中尿酸含量和XOD活性的升高，但是與對(duì)照組相比其差異并未達(dá)到預(yù)想的狀態(tài)。一方面，我們觀察到添食不同濃度的酵母浸粉后，家蠶血淋巴中尿酸含量和XOD活性與對(duì)照組相比均有了不同程度的升高，這意味著酵母浸粉能夠造成家蠶尿酸代謝相關(guān)指標(biāo)的變化；另一方面，結(jié)合家蠶體重增長(zhǎng)率進(jìn)行考慮，雖然酵母浸粉能一定程度地提高家蠶血淋巴中尿酸含量，但同時(shí)隨著酵母浸粉的升高，也引起家蠶體重增長(zhǎng)率的先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是由于家蠶作為寡食性昆蟲，其嗅覺、味覺相對(duì)比較敏感，而酵母浸粉雖自溶性較好，但其濃度過高固有的氣味可能會(huì)引起家蠶食性降低，但具體原因比如食入量是否下降等還有待進(jìn)一步研究。

3.2 家蠶血淋巴中尿酸含量與XOD活性的關(guān)系分析

次黃嘌呤和黃嘌呤是尿酸最為直接的前體物質(zhì)，二者在XOD的作用下進(jìn)行逐級(jí)氧化，從次黃嘌呤氧化成黃嘌呤，再由黃嘌呤最終氧化為尿酸[28-30]。從這條代謝通路上可以看出，XOD活性的強(qiáng)弱在一定程度上影響著生物體內(nèi)黃嘌呤最終氧化成為尿酸的水平。從本試驗(yàn)中尿酸含量和XOD活性的測(cè)定結(jié)果可以看出，添食酵母浸粉同時(shí)引起了家蠶血淋巴中尿酸含量和XOD活性的升高，添食酵母浸粉第3、4、5天時(shí)家蠶血淋巴中尿酸含量和XOD活性的Pearson相關(guān)性分析的相關(guān)系數(shù)分別為0.902、0.858和0.652，且P值均小于0.05，說明家蠶血淋巴中尿酸含量與XOD活性呈正相關(guān)關(guān)系。

3.3 家蠶血淋巴中尿酸含量與甘油三酯含量的關(guān)系分析

尿酸和甘油三酯含量的關(guān)系是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一，而且人類研究表明血液中尿酸含量與甘油三酯含量明顯相關(guān)，并獨(dú)立于飲酒、肥胖和胰島素抵抗等因素[31]。對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)添食酵母浸粉第5天時(shí)家蠶血淋巴中尿酸含量與甘油三酯含量之間存在一定的相關(guān)關(guān)系，二者的相關(guān)系數(shù)為0.509，且P值小于0.05。這說明家蠶和人類在尿酸代謝方面具有極為相似的生理反應(yīng)。

綜上，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過添食一定濃度的酵母浸粉可導(dǎo)致家蠶血淋巴中的尿酸、甘油三酯含量以及XOD活性升高，這與小鼠模型的生理反應(yīng)具有很高的一致性[11-12]，說明可以通過給家蠶添食酵母浸粉造成其血淋巴尿酸代謝相關(guān)指標(biāo)的異常。目前，家蠶在生理、生化、基因組等平臺(tái)上的日趨完善，同時(shí)家蠶具有自然變異多，生活周期較短，個(gè)體大小適中，繁殖容易，方便摘取器官及不觸及倫理問題等諸多優(yōu)點(diǎn)，這些均為將來進(jìn)一步研究家蠶作為研究高尿酸血癥模式動(dòng)物提供了科學(xué)依據(jù)。

表1 家蠶血淋巴中尿酸含量與XOD活性、甘油三酯含量的Pearson相關(guān)性分析

“**”表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

The “**” indicates extremely significant difference (P<0.01), and “*” indicates significant difference (P<0.05).

4 結(jié) 論

添食酵母浸粉能導(dǎo)致家蠶血淋巴中尿酸含量、甘油三酯含量以及XOD活性出現(xiàn)不同程度的升高，從而影響家蠶的尿酸代謝。綜合分析添食不同濃度酵母浸粉對(duì)家蠶體重增長(zhǎng)率以及血淋巴中尿酸含量、XOD活性和甘油三酯含量的影響后得出，酵母浸粉濃度為1%時(shí)效果最佳。

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