王 志 崔廣同 蔡春芳* 任勝杰 邱小亮 丁惠明 張衛(wèi)業(yè) 葉元土

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇省水產(chǎn)動物與營養(yǎng)重點實驗室，蘇州 215123； 2.蘇州市陽澄湖國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)發(fā)展有限公司，蘇州 215123)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)，俗稱青蝦，具有營養(yǎng)價值高、食性雜、生長快、繁殖力強等特點，是我國淡水養(yǎng)殖蝦類的重要品種，僅2016年的產(chǎn)量就達(dá)27.26萬t，同比上年增長2.8%[1]。

關(guān)于日本沼蝦營養(yǎng)需求的研究已有不少報道，已知日本沼蝦對蛋白質(zhì)的需要量在38.0%～41.5%[2-3]，對脂肪的需要量在6%～12%[4-5]，對維生素E的需要量在66.07～212.68 mg/kg[6]，對維生素B6的需要量為80 mg/kg[7]。然而，關(guān)于飼料磷脂水平對日本沼蝦影響的研究相對較少，相關(guān)研究也是多關(guān)注在不同脂肪源的比較上[2,8]。

甲殼類動物消化系統(tǒng)形態(tài)和結(jié)構(gòu)與脊椎動物存在較大差異，例如，甲殼類動物沒有膽囊。膽囊的缺失提示甲殼類動物對脂質(zhì)的乳化作用可能不及脊椎動物。而磷脂是一種具有雙親性的生物活性物質(zhì)，能增強食物中脂質(zhì)的乳化，促進(jìn)甘油三酯、膽固醇和一些脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運[9]。已有大量研究證實磷脂是蝦類生長和存活所必需的[10-13]。磷脂是否能促進(jìn)日本沼蝦的生長和存活以及對脂類的吸收利用目前還不清楚。因此，本試驗擬在不同脂肪水平下研究飼料磷脂水平對日本沼蝦生長和生理的影響，旨在揭示飼料磷脂水平對日本沼蝦脂肪需要量的影響，為甲殼類脂質(zhì)營養(yǎng)生理理論的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料制作

試驗以大豆磷脂、魚油和大豆油為磷脂來源。試驗用大豆磷脂由蘇州鑫裕飼料有限公司提供，其中磷脂酰膽堿含量為15%，磷脂酰乙醇胺的含

量為13%，磷脂酰肌醇含量為9%；試驗用魚油為深海鳀魚油，大豆油為金龍魚大豆油。將魚油和豆油等比例混合均勻，再與大豆磷脂分別按2∶1和1∶2混合，即大豆磷脂分別占脂類混合物的33.3%(低磷脂組)和66.7%(高磷脂組)。將2種脂類混合物分別按3%(低脂肪組)、6%(中脂肪組)、9%(高脂肪組)的比例添加到飼料中，配制出6種等氮等能的試驗飼料。根據(jù)試驗飼料中脂類混合物添加量和大豆磷脂添加量，將6種試驗飼料分別命名為L3P1、L3P2、L6P2、L6P4、L9P3、L9P6，實測試驗飼料中脂肪水平分別為7%、7%、10%、10%、13%、13%。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。制備飼料顆粒時，首先將各種固態(tài)原料經(jīng)粉碎機(1500型，永康市兆申電器有限公司)粉碎，過80目篩并經(jīng)攪拌機(B-20型，廣州市番禺力豐食品機械廠)攪拌，充分混合均勻，其中維生素和礦物質(zhì)等微量原料采用逐級擴(kuò)大法混合，再加入脂類混合物手工搓勻，繼而加入40%的蒸餾水混合均勻，用雙螺桿擠條機(自行研制的設(shè)備)壓制成粒徑為1.0 mm的飼料，風(fēng)干后放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items飼料 DietsL3P1L3P2L6P2L6P4L9P3L9P6羧甲基纖維素鈉 CMC-Na7737376767合計 Total 1 0001 0001 0001 0001 0001 000營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)水分 Moisture989610199100103粗蛋白質(zhì) CP408410412409407410粗脂肪 EE7070101101128130粗灰分 Ash767774797476總能 GE/(MJ/kg)19.5420.2319.7719.5220.3319.64

1)礦物質(zhì)與維生素預(yù)混料為每千克飼料提供Mineral and vitamin premix provided the following per kg of diets：Cu 2.0 mg，Zn 34.3 mg，F(xiàn)e 20.9 mg，Mn 6.2 mg，Se 0.18 mg，I 1.61 mg，Mg 52 mg，Co 0.24 mg，VA 16 000 IU，VD38 000 IU，VE 160 mg，VK314.70 mg，VB117.8 mg，VB248 mg，VB629.52 mg，VB12240 mg，VC (35%) 800 mg，煙酸胺 niacinamide 79.2 mg，D-泛酸鈣 calcium-D-pantothenate 73.6 mg，葉酸 folic acid 6.4 mg，生物素 biotin 640 μg，肌醇 inositol 320 mg。

2)實測值 Measured values。

1.2 試驗蝦和養(yǎng)殖管理

試驗在蘇州市相城區(qū)陽澄湖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園有限公司的配載中心(江蘇省企業(yè)研究生工作站進(jìn)行)。試驗用蝦苗購自本地蝦苗繁育場，幼蝦初始體重為(0.075±0.001) g，健康無病，規(guī)格整齊。試驗蝦在養(yǎng)殖水池暫養(yǎng)15 d，禁食24 h后分于24個100 cm×100 cm×100 cm的塑料缸內(nèi)飼養(yǎng)，養(yǎng)殖缸盛水約300 L，并放置有生物性和非生物性的蝦體附著物。每缸放養(yǎng)150尾。每種試驗飼料投喂4缸試驗蝦，試驗飼料隨機分配。每天07:30和18:30各投喂1次，飽食投喂，發(fā)現(xiàn)死亡蝦撈出并稱重。試驗用水為紗網(wǎng)過濾、沉淀24 h后的湖水。試驗期間水體pH為7.5～8.1，氨氮濃度低于0.05 mg/L，連續(xù)增氧保持溶氧濃度在6.2～7.1 mg/L。每天排污1次，隔天換水1/3，水溫24～28 ℃。飼養(yǎng)4周時稱重1次，飼養(yǎng)8周后，禁食24 h后開始采樣。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能測定

將每缸所有日本沼蝦撈出后分別稱總重，記錄尾數(shù)，用于計算增重率(WGR)、成活率(SR)、特定生長率(SGR)及飼料系數(shù)(FCR)。各生長性能指標(biāo)計算公式如下：

增重率(%)=100×(終末體重- 初始體重)/初始體重； 成活率(%)=100×終末蝦尾數(shù)/初始蝦尾數(shù)； 特定生長率(%)=100×(ln終末體重- ln初始體重)/飼養(yǎng)天數(shù)； 飼料系數(shù)=干物質(zhì)攝入量/蝦體增重。

1.3.2 肝胰腺消化酶活力和抗氧化指標(biāo)的測定

從每缸中隨機選取8尾日本沼蝦，冰浴短暫麻醉，用磷酸鹽緩沖液(PBS)緩慢沖洗，吸水紙吸去表面水分，在無菌操作箱(xw-80，泰州市高港鑫偉試驗設(shè)備廠)中取其肝胰腺，剪碎混勻后，取0.5 g左右組織樣品，加入9倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的生理鹽水制成10%的組織勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，用于測定肝胰腺中消化酶活性和抗氧化指標(biāo)。淀粉酶(amylase)、類胰蛋白酶(typtase)、脂肪酶(lipase)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及總抗氧化能力(T-AOC)與總蛋白含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.3.3 肝胰腺組織學(xué)觀察

制作冷凍切片觀察肝胰腺組織學(xué)，樣品制備參考周永梅等[14]的方法，稍作修改。每缸取3尾日本沼蝦，冰浴麻醉狀態(tài)下取其肝胰腺，用OCT包埋劑包埋后，用Leical 1900(德國Leical公司)冷凍切片機切片，切片10 μm厚，黏附在載破片上，然后采用蘇丹Ⅲ染液染色，70%乙醇洗去多余染液，甘油明膠封片液封片，采用OLYMPUS BX 51(日本Olympus公司)顯微成像系統(tǒng)觀察和拍攝肝胰腺組織形態(tài)。

1.3.4 營養(yǎng)成分分析

采集飼料樣品用于飼料概略養(yǎng)分分析，收集剩余的蝦用于體成分分析。其中，水分含量測定采用低溫冷凍干燥法(LJB 18型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)；粗蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010；所用消化儀：LNK 87型，江蘇省宜興市科教儀器研究所；蒸餾儀：KN 520型，濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司)；粗脂肪含量測定采用索氏抽提法(GB/T 14772—2008)。飼料的總能采用全自動氧彈量熱儀(PARR 6300型，上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司)測定；粗灰分含量采用GB 5009.4—2010中方法測定，樣品先于200 ℃碳化至不冒煙，再于550 ℃陶瓷纖維馬弗爐中(8-10TP型，上海慧泰儀器制造有限公司)灼燒至恒重。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析使用SPSS 11.0軟件進(jìn)行，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和雙因素方差分析(two-way ANOVA)程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能

由表2可知，脂類混合物添加量和大豆磷脂比例對日本沼蝦的終末體重、增重率、特定生長率、飼料系數(shù)和成活率均存在顯著影響(P<0.05)，且二者的交互作用對日本沼蝦的終末體重、增重率、特定生長率也存在顯著影響(P<0.05)。各組日本沼蝦的成活率介于47.8%～66.9%，以L6P4組成活率最高。方差分析結(jié)果顯示，低和中脂肪組的成活率高于高脂肪組(P<0.05)，高磷脂組成活率顯著高于低磷脂組(P<0.05)。增重率和特定生長率均以L6P4組最高，其次是L3P2組，二者顯著高于其他各組(P<0.05)。方差分析結(jié)果顯示，隨著脂肪水平升高，增重率和特定生長率均逐漸下降，而高磷脂組顯著高于低磷脂組(P<0.05)。各組間飼料系數(shù)的差異與增重率和特定生長率相反。

表2 日本沼蝦的生長性能

同一項目下同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same column and under the same item, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 體成分

由表3可知，脂類混合物添加量和大豆磷脂比例對日本沼蝦的蝦體粗脂肪含量存在顯著影響(P<0.05)，而對蝦體粗蛋白質(zhì)和水分含量無顯著影響(P>0.05)，且二者的交互作用對蝦體粗脂肪、粗蛋白質(zhì)和水分含量均無顯著影響(P>0.05)。方差分析結(jié)果顯示，蝦體粗脂肪含量以L9P3組最高，顯著高于其他各組(P<0.05)；隨著飼料中脂肪水平的升高，蝦體粗脂肪含量顯著上升(P<0.05)；高磷脂組蝦體粗脂肪含量顯著低于低磷脂組(P<0.05)。

2.3 肝胰腺消化酶活性和抗氧化指標(biāo)

由表3可知，脂類混合物添加量和大豆磷脂比例及二者的交互作用對日本沼蝦的肝胰腺淀粉酶活性影響不顯著(P>0.05)。日本沼蝦的肝胰腺

類蛋白酶和脂肪酶活性均受脂類混合物添加量的顯著影響(P<0.05)，并均表現(xiàn)為高脂肪組顯著低于中和低脂肪組(P<0.05)。日本沼蝦的肝胰腺脂肪酶活性也受大豆磷脂比例的顯著影響(P<0.05)，高磷脂組顯著高于低磷脂組(P<0.05)。此外，脂類混合物添加量和大豆磷脂比例對脂肪酶活性還具有顯著的交互作用(P<0.05)。

由表3可知，日本沼蝦的肝胰腺SOD活性和T-AOC均受脂類混合物添加量的顯著影響(P<0.05)，而大豆磷脂比例對二者的影響不顯著(P<0.05)。隨著飼料脂肪水平的升高，肝胰腺SOD活性先升高后下降，而T-AOC則逐漸上升。此外，脂類混合物添加量和大豆磷脂比例對日本沼蝦肝胰腺T-AOC還具有顯著的交互作用(P<0.05)。

表3 日本沼蝦的體成分以及肝胰腺消化酶活性和抗氧化指標(biāo)

續(xù)表3項目 Items體成分 Body composition/%水分Moisture粗蛋白質(zhì)CP粗脂肪EE肝胰腺消化酶活性 Digestive enzyme activities in hepatopancreas類胰蛋白酶Typtase/(U/μg prot)脂肪酶Lipase/(U/g prot)淀粉酶Amylase/(U/mg prot)肝胰腺抗氧化指標(biāo) Antioxidant indices in hepatopancreas超氧化物歧化酶SOD (U/μg prot)總抗氧化能力 T-AOC/(U/μg prot)67.778.2114.501.22b3.00307.22a0.145116.161.25方差分析P值 P-value of ANOVA脂類混合物添加量 L0.3160.871<0.0010.027<0.0010.268<0.001<0.001大豆磷脂比例 P0.1540.6250.0010.1070.0040.6480.3090.063交互作用 Interaction0.4890.8870.1800.7190.0390.1590.1880.017

2.4 肝胰腺組織學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，L3P1、L3P2組日本沼蝦肝胰腺中脂肪滴細(xì)小且較少，L6P2、L6P4組出現(xiàn)較大的脂肪顆粒，而L9P3、L9P6組這2個高脂肪水平組日本沼蝦肝胰腺中脂肪滴密集但細(xì)小，且L9P3組脂肪顆粒數(shù)量要多于L9P6組(圖1)。

A：L3P1組；B：L3P2組；C：L6P2組；D：L6P4組；E和G：L9P3組；F和H：L9P6組。肝胰腺組織中染成黃色的為脂肪滴。

A: group L3P1; B: group L3P2; C: group L6P2; D: group L6P4; E and G: group L9P3; f and h: group L9P6. Lipid granules are stained yellow in hepatopancreas tissue.

圖1日本沼蝦肝胰腺冷凍切片

Fig.1 Frozen sections of hepatopancreas for oriental river prawn (Macrobrachiumnipponensis)

3 討 論

蝦類的生長和存活易受水環(huán)境中的一些脅迫因子的影響，如水體中氨氮濃度[15]、亞硝酸鹽濃度[16]、pH[17]、溶氧濃度[18]等；此外，日本沼蝦喜營附著生活，附著基的數(shù)量和質(zhì)量也影響其生長和存活。本試驗中，養(yǎng)殖用水為過濾沉淀后的陽澄湖水，同時養(yǎng)殖缸內(nèi)投放盆栽伊樂藻供日本沼蝦依附攀爬，并采用納米管充氧，溶氧量高，氣泡細(xì)小均勻，養(yǎng)殖過程中所監(jiān)測的水質(zhì)因子均在日本沼蝦生長的安全閾值內(nèi)，為日本沼蝦的生長、脫殼、攀附營造了一個合適的條件。8周的生長試驗結(jié)果顯示，各組日本沼蝦的成活率在47.8%～66.8%，增重率在173.67%～272.02%，飼料系數(shù)在1.31～1.70，表明日本沼蝦生長良好，試驗結(jié)果能夠充分反映飼料的差異。

本研究中，雙因素方差分析結(jié)果顯示脂類混合物添加量為6%(飼料脂肪水平為10%)時日本沼蝦的成活率最高，但增重率卻顯著低于脂類混合物添加量為3%(飼料脂肪水平為7%)時。盡管如此，這2組的特定生長率和飼料系數(shù)差異不顯著，且單因素方差分析結(jié)果顯示，L6P4組(飼料脂肪水平為10%)日本沼蝦的特定生長率最高。日本沼蝦具有相互殘殺的習(xí)性，因此擁擠脅迫效應(yīng)比較明顯。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)放養(yǎng)密度高時日本沼蝦成活率往往偏低，而相同放養(yǎng)密度下成活率低時個體增重率往往較高?？紤]到高成活率導(dǎo)致的擁擠脅迫效應(yīng)，有理由相信飼料中10%的脂肪水平比較接近日本沼蝦對脂肪的需要量。

Hari等[19]發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)在飼料脂肪水平為6%～8%時生長最好，若如果脂肪水平過高(>12%)，則對其生長有負(fù)面效應(yīng)。黃凱等[20]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)在飼料脂肪水平為8.47%時增重率和成活率最高，飼料脂肪水平過高或過低時對生長有一定抑制作用。本試驗結(jié)果顯示，飼料脂肪水平由10%提高到13%時，日本沼蝦的特定生長率大幅度下降，與上述報道相支持。此外，有研究表明脂肪酶的活性會受到飼料脂肪水平的誘導(dǎo)，且二者具有一定的相關(guān)性[21]。本試驗中消化酶活性測定結(jié)果表明，飼料脂肪水平為13%時，日本沼蝦肝胰腺中類胰蛋白酶、脂肪酶的活性顯著低于飼料脂肪水平為10%和7%時。肝胰腺是甲殼動物重要的消化及吸收器官，消化酶活性下降提示消化吸收能力下降，這可能是其前期體內(nèi)脂肪積累較多后的自我調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果還顯示，投喂高脂飼料(飼料脂肪水平為13%)的日本沼蝦體脂含量最高(表3)，肝組織中脂肪積累也最高(圖1)。

甲殼類動物幼體自身合成磷脂能力有限[22]，因此飼料中添加不同形態(tài)的磷脂是仔蝦及幼蝦生長和存活所必需的[10-13]。在凡納濱對蝦[10,12]和斑節(jié)對蝦[23]的研究中均發(fā)現(xiàn)，隨著飼料磷脂水平的升高，幼蝦的生長性能顯著提高。Sui等[24]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量卵磷脂可以加快中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)蚤狀幼體和大眼幼體的蛻殼和生長，提高其成活率。侯迎梅等[25]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中適宜水平(41.96 g/kg)的大豆磷脂可以提高三疣梭子蟹幼蟹的生長性能和飼料利用率。此外，由于大豆磷脂富含不飽和脂肪酸，對幼齡動物器官發(fā)育、機體成長也具有非常重要的促進(jìn)作用[26-28]。本試驗結(jié)果表明，高磷脂飼料更有利于日本沼蝦的生長，飼料效率更高，與上述報道相支持。

已有研究表明，飼料中補充磷脂可以提高脂質(zhì)的利用效率[29]。本試驗結(jié)果顯示，飼料脂肪(以脂類混合物添加量顯示)與磷脂水平(以大豆磷脂比例顯示)對日本沼蝦生長性能(表2)、肝胰腺脂肪酶活性(表3)及肝胰臟T-AOC(表3)具有顯著的交互作用，對成活率的交互作用也趨于顯著(表2)，表現(xiàn)為隨著磷脂水平的升高，高脂肪組日本沼蝦的生長性能更好，成活率更高，脂肪酶活性增強，體脂(表3)和肝脂(圖1)含量降低。這可能是由于大豆磷脂分子中存在疏水性的脂肪酸鏈和親水基團(tuán)，可起到表面活性劑和乳化劑的作用，能將進(jìn)入小腸內(nèi)的脂肪進(jìn)一步分散，增大脂肪及脂溶性物質(zhì)與腸黏膜的接觸面積，從而提高脂肪的消化吸收率。同時，磷脂是脂蛋白裝配和分泌所必需的成分，對乳糜微粒或脂蛋白的合成和分泌有特殊作用[30]，可以通過對脂蛋白合成的影響來調(diào)節(jié)機體內(nèi)脂類的代謝。這一現(xiàn)象提示日本沼蝦飼料中脂肪和磷脂應(yīng)保持一定的比例關(guān)系，但其適宜的比例關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)中，SOD與T-AOC是生物體清除活性氧自由基能力的重要表征。磷脂具有抗氧化性[31]。徐麗珊等[32]發(fā)現(xiàn)大豆磷脂可提高小鼠肝臟抗氧化能力，且高磷脂組顯著高于低磷脂組。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼料磷脂比例對日本沼蝦肝胰腺SOD活性和T-AOC均無顯著影響(表3)，這可能與磷脂的乳化特性有關(guān)，當(dāng)添加量超過其臨界膠束濃度后，磷脂的乳化能力趨于穩(wěn)定，乳化效果不再增強[33]。

4 結(jié) 論

綜上所述，日本沼蝦飼料中脂肪與磷脂間應(yīng)保持一定的比例。根據(jù)本試驗結(jié)果，飼料中脂肪水平為10%、大豆磷脂添加量為4%時對日本沼蝦比較適宜。

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