趙 芳 高 超 王 根 趙國(guó)棟 李曉斌 馬 晨 楊開倫

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

褪黑素(melatonin,MT)廣泛存在于單細(xì)胞藻類、植物、無脊椎動(dòng)物及高等動(dòng)物中。松果體是動(dòng)物合成褪黑素的重要組織，但是腸道中褪黑素的含量是松果體的400倍[1]。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的褪黑素具有廣泛的生物學(xué)作用，褪黑素是一種非酶類抗氧化劑，能清除羥基和不同的活性氧，增加抗氧化酶的表達(dá)和活力[2]；褪黑素可調(diào)控動(dòng)物的繁殖機(jī)能、調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、促進(jìn)胚胎發(fā)育[3]；褪黑素對(duì)先天性免疫和獲得性免疫均具有促進(jìn)作用[4]?；谕屎谒貜V泛的生物學(xué)作用，適當(dāng)提高特定生理階段時(shí)動(dòng)物機(jī)體中褪黑素含量可能會(huì)有積極意義。調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)褪黑素含量的方法，一是從靜脈直接注射或通過飼糧補(bǔ)喂褪黑素[5-7]；二是補(bǔ)喂或注射褪黑素的前體物質(zhì)[包括色氨酸(tryptophan,Trp)、5-羥色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)等][1,8]。在對(duì)反芻動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加色氨酸、過瘤胃色氨酸后并未顯著影響泌乳期奶牛白天和夜間時(shí)血漿中褪黑素的含量[9]；腹腔注射500 mg/kg BW的色氨酸，綿羊血漿中褪黑素含量并未顯著增加，腹腔注射5-羥色氨酸則顯著提高了綿羊血漿中褪黑素的含量[8]。由此看來，色氨酸作為褪黑素合成的前體物質(zhì)并進(jìn)而發(fā)揮影響褪黑素合成的作用可能存在種屬差異性。腹腔注射5-羥色氨酸可影響綿羊血漿中褪黑素含量，但通過胃腸給予方式是否具有同樣的作用？由于瘤胃微生物對(duì)氨基酸普遍具有降解作用，而目前尚未有5-羥色氨酸是否會(huì)在綿羊瘤胃中降解的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)的目的是比較綿羊在補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸后不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)血漿中5-羥色氨酸、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、褪黑素含量的變化，探究通過補(bǔ)喂5-羥色氨酸調(diào)節(jié)綿羊機(jī)體中褪黑素分泌模式及含量的可能性，為通過在飼糧中添加5-羥色氨酸來調(diào)控反芻動(dòng)物機(jī)體褪黑素合成的技術(shù)方法提供科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2017年5月13至2017年5月29

日在新疆惠康畜牧生物科技有限公司羊場(chǎng)進(jìn)行，采集血樣當(dāng)天日出時(shí)間為06:32，日落時(shí)間為21:44。

1.2 試驗(yàn)材料

5-羥色氨酸購(gòu)自武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，純度為98%；瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸是以5-羥色氨酸為原料，由北京亞禾營(yíng)養(yǎng)高新技術(shù)有限責(zé)任公司加工制成，其中5-羥色氨酸有效含量為45.00%，過瘤胃率為88.60%。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取健康、1歲、平均體重為(55.78±3.24) kg(體重在50.5～65.8 kg)的陶賽特母羊18只，按體重分為3組，每組6只，分別為對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組，所有羊只飼喂同一營(yíng)養(yǎng)水平的粉狀精料(購(gòu)自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司)，每天每只羊的粉狀精料飼喂量為體重的1%，玉米青貯飼喂量為0.6 kg，混合干草(苜蓿∶麥秸=3∶7)自由采食，在此基礎(chǔ)上，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組羊只分別補(bǔ)喂50 mg/kg BW 5-羥色氨酸、111 mg/kg BW瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸(補(bǔ)喂量參考Huether等[10]的研究結(jié)果，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組補(bǔ)喂的5-羥色氨酸的有效劑量相同，均為50 mg/kg BW)，進(jìn)行15 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中使用的粉狀精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1，玉米青貯、苜蓿、麥秸的營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

表1 粉狀精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

預(yù)混料為每千克精料提供The premix provided the following per kg of the concentrate：VA 480 IU，VB1816 mg，VB2333 mg，VB649 mg，VD 70 IU，VE 21 333 IU，泛酸 pantothenic acid 20 mg，煙酰胺 nicotinamide 485 mg，Cu (as copper sulfate) 11 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 35 mg，Mn (as manganese sulfate) 33 mg，Zn (as zinc sulfate) 31 mg，I (as potassium iodide) 2 mg，Se (as sodium selenite)6 mg，Co (as cobalt chloride) 1 mg。

表2 玉米青貯、苜蓿、麥秸的營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間，將每天每只羊的粉狀精料和玉米青貯、5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸平均分為2份，分別于早上(07:30)、下午(19:30)飼喂，飼喂時(shí)將5-羥色氨酸或瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸與50 g粉狀精料混合后飼喂，待綿羊攝入完畢后再飼喂其他粉狀精料和玉米青貯。飼喂粉狀精料、玉米青貯時(shí)為單欄飼養(yǎng)，采食完畢后試驗(yàn)羊只在運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中自由活動(dòng)。夜晚時(shí)羊舍使用燈泡(250 lx)照明。

1.5 樣品的采集與處理

于試驗(yàn)的第16天采集血液，血液采集時(shí)間點(diǎn)分別為早上(07:30)和下午飼喂前0 h(19:30)以及飼喂后1.5、3.0、6.0、9.0 h，通過頸靜脈采集血液至肝素鈉抗凝的采血管中，3 500 r/min離心15 min制備血漿，用移液槍小心吸取血漿至1.5 mL Eppendorf管中，立即放入-20 ℃冰箱中冷凍保存。血液采集過程中所有羊只每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血液采集過程不超過10 min。

1.6 樣品的測(cè)定

綿羊血漿送至北京華英生物技術(shù)研究所進(jìn)行5-羥色氨酸、色氨酸、5-羥色胺、褪黑素含量的測(cè)定。5-羥色氨酸、褪黑素含量測(cè)定使用放射免疫法(XH-6020全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀，西安核儀器廠)，5-羥色胺含量測(cè)定使用酶聯(lián)免疫法(華衛(wèi)德朗DR-200BS酶標(biāo)分析儀，無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)，色氨酸含量測(cè)定使用比色法(A6半自動(dòng)生化儀，北京松上技術(shù)有限公司)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行初步整理，試驗(yàn)結(jié)果以平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，各組間平均值的多重比較采用Duncan氏法。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥色氨酸含量的影響

由表3、圖1可知，在早上飼喂后1.5、3.0、6.0、9.0 h，即09:00—17:00，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組血漿中5-羥色氨酸含量均高于對(duì)照組，且試驗(yàn)Ⅰ組在早上飼喂后1.5、3.0、9.0 h與對(duì)照組的差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)，試驗(yàn)Ⅱ組在早上飼喂后1.5、9.0 h與對(duì)照組的差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)；但在下午飼喂前0 h(19:30時(shí))，對(duì)照組和各試驗(yàn)組血漿中5-羥色氨酸含量接近(P>0.05)；在下午飼喂后的不同時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組血漿中5-羥色氨酸含量均高于對(duì)照組，且在下午飼喂后1.5 h(21:00時(shí))與對(duì)照組的差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)；在下午飼喂后1.5、3.0、6.0 h，各試驗(yàn)組血漿中5-羥色氨酸含量均增加，但對(duì)照組血漿中5-羥色氨酸含量在下午飼喂后1.5 h下降。

2.2 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中色氨酸含量的影響

由表4、圖2可知，早上飼喂后1.5 h(09:00時(shí))，各組血漿中色氨酸含量呈增加趨勢(shì)；在早上飼喂后3.0～6.0 h，對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅱ組血漿中色氨酸含量呈現(xiàn)出先下降后又上升的趨勢(shì)，而試驗(yàn)Ⅰ組血漿中色氨酸含量則持續(xù)增加，但在各采樣時(shí)間點(diǎn)各組間差異均不顯著(P>0.05)；在下午飼喂前0 h(19:30時(shí))，各組血漿中色氨酸含量達(dá)到了最大值，且對(duì)照組高于試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組，但差異不顯著(P>0.05)；在下午飼喂后的1.5、3.0、6.0 h，即21:00、23:00、02:00時(shí)，各組血漿中色氨酸含量均呈下降趨勢(shì)，且同一采樣時(shí)間點(diǎn)各組間差異不顯著(P>0.05)；在下午飼喂后9 h(05:00時(shí))試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組血漿中色氨酸含量呈增加趨勢(shì)，而對(duì)照組仍為下降趨勢(shì)。

表3 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥色氨酸含量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

“→”表示飼喂時(shí)間，“—”表示夜晚。下圖同。

“→” mean the time of feeding, and “—” mean night. The same as below.

圖1補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥色氨酸含量的影響

Fig.1 Effects of supplement with 5-HTP, rumen protected 5-HTP on plasma 5-HTP content of sheep

2.3 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥色胺含量的影響

由表5、圖3可知，在早上飼喂前0 h和飼喂后1.5、3.0、6.0、9.0 h，即07:30、09:00、11:00、14:00、17:00時(shí)，各組血漿中5-羥色胺含量均在320～285 ng/mL，各組間差異不顯著(P>0.05)；而在下午飼喂前0 h(19:30時(shí))，各組血漿中5-羥色胺含量均有所下降，且試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組均低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)；隨后，在下午飼喂后1.5、3.0、6.0 h，即21:00、23：00、02:00時(shí)，各組血漿中5-羥色胺含量呈波動(dòng)性上升；但在下午飼喂后9 h(05：00時(shí))各組血漿中5-羥色胺含量均有所下降。

表4 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中色氨酸含量的影響

圖2 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中色氨酸含量的影響Fig.2 Effects of diet supplemented with 5-HTP, rumen protected 5-HTP on plasma tryptophan content of sheep表5 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥色胺含量的影響Table 5 Effects of diet supplemented with 5-HTP, rumen protected 5-HTP on plasma 5-HT content of sheep (n=6) ng/mL

續(xù)表5采樣時(shí)間點(diǎn)Sampling time points鐘點(diǎn)時(shí)間Clock time對(duì)照組Control group試驗(yàn)Ⅰ組Trail group Ⅰ試驗(yàn)Ⅱ組Trail group Ⅱ早上飼喂后9.0 h 9.0 h after feeding in the morning17:00305.10±45.33320.50±48.10298.30±9.31下午飼喂前0 h 0 h before feeding in the afternoon19:30279.88±28.31273.05±43.72252.85±55.91下午飼喂后1.5 h 1.5 h after feeding in the after-noon21:00281.53±48.27316.14±20.30299.29±53.89下午飼喂后3.0 h 3.0 h after feeding in the after-noon23:00282.51±80.29298.08±27.51289.32±43.79下午飼喂后6.0 h 6.0 h after feeding in the after-noon02:00340.72±15.52318.57±37.23292.79±51.58下午飼喂后9.0 h 9.0 h after feeding in the after-noon05:00312.38±54.09286.90±67.46282.40±58.71

圖3 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥色胺含量的影響Fig.3 Effect of diet supplemented with 5-HTP, rumen protected 5-HTP on plasma 5-HT content of sheep

2.4 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中褪黑素含量的影響

由表6、圖4可知，在早上飼喂后1.5 h(09:00時(shí))，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組血漿中褪黑素含量均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；在早上飼喂后3.0～9.0 h(11:00—17:00時(shí))，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組血漿中褪黑素含量均高于對(duì)照組，其中在早上飼喂后6.0 h(14:00時(shí))試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組與對(duì)照組的差異均達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)；在下午飼喂后1.5、3.0、6.0、9.0 h，對(duì)照組以及試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組血漿中褪黑素含量均呈波動(dòng)性上升，且在下午飼喂后1.5、3.0、6.0 h試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，在下午飼喂后9.0 h試驗(yàn)Ⅱ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表6 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中褪黑素含量的影響

續(xù)表6采樣時(shí)間點(diǎn)Sampling time points鐘點(diǎn)時(shí)間Clock time對(duì)照組Control group試驗(yàn)Ⅰ組Trail group Ⅰ試驗(yàn)Ⅱ組Trail group Ⅱ下午飼喂后1.5 h 1.5 h after feeding in the after-noon21:0036.40±7.90Bb82.31±10.68Aa89.86±7.56Aa下午飼喂后3.0 h 3.0 h after feeding in the after-noon23:0033.67±2.69Bb82.95±16.20Aa74.14±16.26Aa下午飼喂后6.0 h 6.0 h after feeding in the after-noon02:0038.60±7.14Bc69.16±18.91Ab92.72±7.46Aa下午飼喂后9.0 h 9.0 h after feeding in the after-noon05:0055.18±5.43b76.26±19.49ab96.77±20.79a

圖4 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中褪黑素含量的影響Fig.4 Effects of diet supplemented with 5-HTP, rumen protected 5-HTP on plasma melatonin content of sheep

3 討 論

3.1 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥色氨酸含量的影響

綿羊在飼喂前后血液中5-羥色氨酸含量的動(dòng)態(tài)變化少見報(bào)道。本試驗(yàn)顯示，在白天，對(duì)照組綿羊在飼喂前后的12 h內(nèi)，血漿中5-羥色氨酸含量的變化呈現(xiàn)出“W”模式(血漿中5-羥色氨酸含量最高點(diǎn)分別在飼喂前0 h及飼喂后6.0 h)。在試驗(yàn)Ⅰ組(即補(bǔ)喂5-羥色氨酸組)，白天時(shí)攝入5-羥色氨酸后血漿中5-羥色氨酸含量分別在早上飼喂后3.0、9.0 h(11:00、17:00時(shí))出現(xiàn)了2個(gè)含量高峰，即出現(xiàn)了“雙峰”模式，這與5-羥色氨酸在健康人體中的代謝模式相似，可能是與胃部的2次排空作用和廣泛存在的肝腸循環(huán)有關(guān)[11]。在試驗(yàn)Ⅱ組(即補(bǔ)喂瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸組)，血漿中5-羥色氨酸含量的變化則表現(xiàn)為“單峰”模式(在飼喂后6.0 h血漿5-羥色氨酸含量達(dá)到最高)。

在下午飼喂后直到夜間(即19:30—05:00)，對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組的血漿中5-羥色氨酸含量均在比白天平均含量較高的水平上變化。對(duì)于對(duì)照組，這可能是腸道、松果體等內(nèi)源性5-羥色氨酸合成增加的結(jié)果；對(duì)于2個(gè)試驗(yàn)組，除內(nèi)源性5-羥色氨酸增加之外，補(bǔ)喂的5-羥色氨酸也是重要的來源。研究表明，給人口服2 mg/kg BW的5-羥色氨酸后，70%的5-羥色氨酸會(huì)進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)，血漿中5-羥色氨酸含量在口服5-羥色氨酸后2 h開始增加[12]。另外，恐慌病人通過靜脈分別注射10、20、40 mg的5-羥色氨酸，在注射后血液中5-羥色氨酸含量開始顯著增加，在注射后30 min時(shí)血液中5-羥色氨酸含量達(dá)到最大值，隨后下降，且血液中5-羥色氨酸含量與5-羥色氨酸注射量存在明顯的劑量效應(yīng)[13]。

在本試驗(yàn)中，早上飼喂后3.0、6.0 h(11:00、14:00時(shí))及下午飼喂后1.5 h(21:00時(shí))，攝入5-羥色氨酸綿羊血漿中5-羥色氨酸含量高于攝入瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸綿羊血漿中5-羥色氨酸含量，這是由于5-羥色氨酸進(jìn)入綿羊消化道后可快速地被吸收，而瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸表面存在包衣，在瘤胃內(nèi)可能無法全部降解，到達(dá)腸道后才會(huì)使包衣內(nèi)的5-羥色氨酸釋放出來，致使瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸在綿羊體內(nèi)的吸收存在延遲現(xiàn)象。然而，5-羥色氨酸在瘤胃內(nèi)能否降解目前尚不明確，值得進(jìn)一步研究。

3.2 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中色氨酸含量的影響

在本試驗(yàn)中，在所采樣的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，2個(gè)試驗(yàn)組血漿中色氨酸含量與對(duì)照組血漿中色氨酸含量相近，且變化趨勢(shì)基本一致，表明補(bǔ)喂5-羥色氨酸或瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊色氨酸吸收、代謝沒有產(chǎn)生顯著影響。研究表明，5-羥色氨酸在腸道中的吸收方式為主動(dòng)運(yùn)輸[14]，而氨基酸的吸收主要是通過氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體來實(shí)現(xiàn)[15]，因此，可以認(rèn)為，5-羥色氨酸、色氨酸在動(dòng)物腸道轉(zhuǎn)運(yùn)(即吸收)上不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。腸道對(duì)5-羥色氨酸吸收的詳細(xì)機(jī)制仍不明確。

動(dòng)物體內(nèi)血漿中氨基酸含量的變化受采食時(shí)間、飼糧組成等的影響[16]。Purser等[17]以羔羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象，研究飼喂蛋白質(zhì)水平為8.1%的飼糧后，24 h內(nèi)血漿中氨基酸含量的變化，結(jié)果表明，飼喂后3 h血漿中氨基酸含量增加。在本試驗(yàn)中，早上飼喂后1.5～9.0 h(09:00—19:30時(shí))，各組血漿中色氨酸含量呈波動(dòng)性增加，這與Purser等[17]的研究結(jié)果一致。在下午飼喂后的1.5、3.0、6.0 h(21:00—02:00時(shí))各組血漿中色氨酸含量均呈下降趨勢(shì)，而此時(shí)血漿中5-羥色氨酸含量呈增加趨勢(shì)，因此下午飼喂后機(jī)體中的色氨酸可能在色氨酸羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化為了5-羥色氨酸，使血漿中5-羥色氨酸含量增加。下午飼喂后9.0 h(05:00時(shí))試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組血漿中色氨酸含量呈增加趨勢(shì)，而對(duì)照組仍為下降趨勢(shì)，在這段時(shí)間內(nèi)是綿羊體內(nèi)褪黑素合成量最高的階段，攝入的5-羥色氨酸或瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸可作為褪黑素合成的間接前體物質(zhì)，用于褪黑素的合成，使機(jī)體中色氨酸的消耗量降低，導(dǎo)致血漿中色氨酸含量增加；而對(duì)照組綿羊?yàn)槭寡獫{中褪黑素含量保持較高含量，需要褪黑素的前體物質(zhì)，就對(duì)照組綿羊而言，機(jī)體中褪黑素的間接前體物質(zhì)只有色氨酸，因此對(duì)照組綿羊體內(nèi)的色氨酸被用于褪黑素的合成，導(dǎo)致對(duì)照組綿羊血漿中色氨酸含量持續(xù)降低。

3.3 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥色胺含量的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在所采樣的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，2個(gè)試驗(yàn)組血漿中5-羥色胺含量與對(duì)照組血漿中5-羥色胺含量相近，且變化趨勢(shì)基本一致。5-羥色胺既是色氨酸、5-羥色氨酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，也是生成褪黑素的直接底物；同時(shí)，機(jī)體中的5-羥色胺主要通過尿液排出，哺乳動(dòng)物肝臟和腎臟中含有大量的可降解5-羥色胺的酶[18]，約2/3的5-羥色胺在肝臟與硫酸或葡萄糖醛酸結(jié)合后排出，或?qū)⑦胚釘嗔讯纸?；約1/3經(jīng)單氨氧化酶作用氧化脫氨形成5-羥基吲哚乙酸后從尿排出[19]。因此，動(dòng)物機(jī)體血液中的5-羥色胺含量受到生成、轉(zhuǎn)化及直接代謝排泄等3種主要過程的調(diào)節(jié)。Wa等[20]于白天時(shí)給健康青年男性連續(xù)靜脈注射5-羥色氨酸60 min，注射量為10 μg/(kg·min)，注射前尿液中5-羥色胺的排出量小于0.7 nmol/min，而在注射5-羥色氨酸后，尿液中5-羥色胺排出量達(dá)到了為(412±92) nmol/min，但血液中5-羥色胺含量并未發(fā)生顯著的變化，為788～813 nmol/L，這表明在使用5-羥色氨酸處理后，生成的5-羥色胺主要通過尿液排出，而血液中的5-羥色胺含量并未發(fā)生顯著變化。由此可以推測(cè)，動(dòng)物機(jī)體血漿或血清中的5-羥色胺含量并不一定與褪黑素含量的變化具有一致性。在本試驗(yàn)中，早上飼喂前0 h和飼喂后1.5、3.0、6.0、9.0 h(07:30—17:00時(shí))，各組血漿中5-羥色胺含量在320～285 ng/mL，這與Wa等[20]的研究結(jié)果證實(shí)外源性5-羥色氨酸對(duì)血漿中5-羥色胺含量無顯著影響的結(jié)果相一致，但本試驗(yàn)未收集母羊尿液，尿液中5-羥色胺含量的變化情況尚不明確，在今后的研究中可收集母羊尿液，測(cè)定尿液中5-羥色胺含量，驗(yàn)證母羊通過飼糧攝入5-羥色氨酸后尿液中5-羥色胺的含量是否增加。

3.4 補(bǔ)喂5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中褪黑素含量的影響

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，褪黑素主要在松果體、腸道中合成，其他組織器官也可合成少量褪黑素，但只有松果體和視網(wǎng)膜具有周期性分泌的特點(diǎn)[21-22]。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的褪黑素含量存在明顯的晝夜節(jié)律，白天時(shí)含量低，夜晚時(shí)含量高[23]。濟(jì)寧青山羊春季12:00、18:00時(shí)血液中褪黑素含量分別為(11.44±1.77) pg/mL、(17.61±2.53) pg/mL，00:00、03:00時(shí)血液中褪黑素含量分別為(72.25±5.08) pg/mL、(66.20±4.49) pg/mL[24]。小尾寒羊、同羊和灘羊血液中褪黑素含量在春分、夏至、秋分時(shí)存在著明顯的季節(jié)性變化，在春分和秋分時(shí)平均含量相對(duì)較低，在夏至?xí)r明顯升高，且在夏至日沒時(shí)褪黑素含量開始增加[25]。本試驗(yàn)中，白天時(shí)對(duì)照組綿羊血液中褪黑素含量為38.80～59.15 pg/mL，而在23:00—05:00時(shí)對(duì)照組綿羊血液中褪黑素含量呈增加趨勢(shì)(33.67～55.18 pg/mL)，但并未表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律，這可能與夜間時(shí)羊舍的光照有關(guān)，影響了褪黑素的合成與分泌[26]。此外，在本試驗(yàn)中，選用的是繁殖季節(jié)性不是很強(qiáng)的陶賽特母羊，本試驗(yàn)是在夏季(5月份)進(jìn)行的，因此，綿羊褪黑素分泌的晝夜節(jié)律可能表現(xiàn)不明顯。

研究表明，外源性褪黑素前體物質(zhì)可增加綿羊血液中褪黑素含量。Namboodiri等[8]于07:00時(shí)給綿羊分別腹腔注射5-羥色氨酸20、200 mg/kg BW，12:00時(shí)血漿中褪黑素含量分別為64.32、349.89 pg/mL，而對(duì)照組綿羊血漿中褪黑素含量為23.00 pg/mL。Sugden等[27]給綿羊分別腹腔注射20、200 mg/kg BW 5-羥色氨酸，5 h后綿羊松果體中5-羥色胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(AA-NAT)和羥基吲哚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(HIOMT)的活性均增加。在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組在下午飼喂后血漿中褪黑素含量最高分別達(dá)到(82.95±16.20)、(92.72±7.46) pg/mL，高于Namboodiri等[8]使用20 mg/kg BW 5-羥色氨酸的試驗(yàn)結(jié)果，而低于使用200 mg/kg BW 5-羥色氨酸的試驗(yàn)結(jié)果，表明5-羥色氨酸調(diào)節(jié)綿羊血液中褪黑素含量可能存在劑量效應(yīng)，這可能與5-羥色氨酸轉(zhuǎn)化為褪黑素過程中的酶有關(guān)[27-28]。

Shindo等[11]使用[14C]標(biāo)記的5-羥色氨酸在動(dòng)物機(jī)體中得到證實(shí)，組織和器官可快速、大量地?cái)z取5-羥色氨酸。本試驗(yàn)中，在早上飼喂后1.5 h(09:00時(shí))2個(gè)試驗(yàn)組血漿中褪黑素含量均顯著低于對(duì)照組，這可能是由于進(jìn)入綿羊機(jī)體內(nèi)的5-羥色氨酸被組織器官快速攝取，使血漿中5-羥色氨酸含量下降，使褪黑素的前體物質(zhì)含量降低，從而導(dǎo)致血漿中褪黑素含量降低。

在早上飼喂后3.0～6.0 h(11:00—17:00時(shí))，2個(gè)試驗(yàn)組血漿中褪黑素含量均高于對(duì)照組，且早上飼喂后3.0～6.0 h(11:00—17:00時(shí))血漿中褪黑素含量接近夜晚時(shí)血漿中褪黑素的含量，表明綿羊口服攝入5-羥色氨酸、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸后，通過腸道吸收轉(zhuǎn)化可有效地改變白天時(shí)綿羊血漿中褪黑素的分泌模式和含量，這與Namboodiri等[8]在白天時(shí)給綿羊腹腔注射5-羥色氨酸(20、200 mg/kg BW)后2～5 h內(nèi)綿羊血漿中褪黑素含量顯著增加的結(jié)果一致。在夜晚時(shí)，本試驗(yàn)中綿羊下午飼喂前0 h及飼喂后1.5、3.0、6.0、9.0 h(19:30—05:00時(shí))，2個(gè)試驗(yàn)組血漿中褪黑素含量仍顯著高于對(duì)照組，但Namboodiri等[8]夜晚時(shí)給綿羊腹腔注射5-羥色氨酸(20、200 mg/kg BW)后，血液中褪黑素含量并未出現(xiàn)顯著增加，這可能與5-羥色氨酸的處理方式有關(guān)。綜合本試驗(yàn)3個(gè)組綿羊血漿中5-羥色氨酸含量的變化模式及5-羥色氨酸的代謝路徑，在白天，5-羥色氨酸含量的“消長(zhǎng)”變化與褪黑素含量的“長(zhǎng)消”變化之間具有較好的一致性；在夜間，5-羥色氨酸含量的“消長(zhǎng)”變化與褪黑素含量的“長(zhǎng)消”變化之間的一致性較差。因此，通過飼糧飼喂的方式攝入5-羥色氨酸或瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸均可有效調(diào)控白天綿羊機(jī)體內(nèi)褪黑素的分泌模式和分泌量。由于綿羊機(jī)體中褪黑素的分泌存在明顯的季節(jié)性差異，本試驗(yàn)只研究了夏季時(shí)5-羥色氨酸對(duì)綿羊血液中褪黑素含量的影響，后期可比較不同季節(jié)時(shí)飼喂5-羥色氨酸對(duì)綿羊血液中褪黑素含量的影響。

就攝入5-羥色氨酸或瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)綿羊血漿中褪黑素含量的影響而言，在早上飼喂后3.0、6.0 h(即11:00、14:00時(shí))及下午飼喂后1.5、6.0、9.0 h(即21:00、02:00、05:00時(shí))補(bǔ)喂瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸組血漿中褪黑素含量均高于補(bǔ)喂5-羥色氨酸組，表明瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸對(duì)增加綿羊血漿中褪黑素含量更加有效。

4 結(jié) 論

補(bǔ)喂5-羥色氨酸(50 mg/kg BW)、瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸(111 mg/kg BW)均可顯著提高綿羊血漿中5-羥色氨酸含量，改變白天機(jī)體中褪黑素分泌模式及含量，且瘤胃保護(hù)性5-羥色氨酸的作用更有效，但對(duì)血漿中色氨酸、5-羥色胺含量均無顯著影響。

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