江興華 崔龍萍 張小蘭 陳麗萍 阮鷺靜 福州大北農生物技術有限公司 福州 350014

豬圓環(huán)病毒病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大經濟影響性疾病，也是我國養(yǎng)豬業(yè)的三大疾病之一，與豬瘟和豬藍耳病并稱我國養(yǎng)豬業(yè)的三座大山[1]。豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）可引發(fā)斷乳后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬繁殖障礙、母豬流產死亡綜合征、育肥豬的慢性呼吸道病綜合征和豬皮炎和腎病綜合征等多種疾病,給養(yǎng)豬業(yè)帶來很大的經濟損失[2]。目前為止，疫苗免疫仍是控制PVC2感染引起相關疾病的重要手段，在疫苗的研制中，病毒抗原含量對免疫效果影響較大，由于PVC2在細胞中不產生細胞病變，體外增殖能力差，增殖滴度不高[3]。傳統(tǒng)的生產豬圓環(huán)病毒的方法是使用轉瓶細胞培養(yǎng)，隨著細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展，應用微載體生物反應器技術培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒可大大提高抗原效價。

微載體系統(tǒng)細胞培養(yǎng)技術自1967年被用于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),使動物細胞培養(yǎng)進入高密度培養(yǎng)階段,經過幾十年的發(fā)展,該技術已日漸完善和成熟,正逐漸取代轉瓶的生產模式[4]，為了提高微載體生物反應器培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的抗原效價，本試驗旨在對微載體生物反應器接種細胞時使用不同的接種密度培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型進行研究，觀察不同組的貼壁情況、不同時間的細胞狀態(tài)、細胞增長情況，對比最終收獲的抗原效價，從而選擇微載體生物反應器的細胞最佳接種密度培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒，提高抗原效價，提高豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 試驗用微載體、干粉培養(yǎng)基 微載體型號Cytodex1，購自美國GE公司；干粉培養(yǎng)基MEM購自Gibco公司。

1.2 試驗用細胞與種毒 PK15細胞，PCV2種毒（DBN~SX07株）均由福州大北農生物技術有限公司提供，PCV2種毒效價為106.5TCID50/mL。

1.3 試驗設備 微載體生物反應器購自廣州齊志工程設備有限公司；倒置顯微鏡購自上海光學儀器五廠；熒光顯微鏡購自日本尼康光學儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微載體、生物反應器的準備、滅菌、無檢 稱取4份10 g微載體，分別裝在4個已硅化好的玻璃瓶中，各加600 mL PBS浸泡、過夜，然后棄去PBS，再加入新鮮PBS漂洗3次，最后一次留下適當體積的PBS，將4個裝有漂洗過的微載體的玻璃瓶進行121℃、30 min高壓滅菌，備用。準備4臺相同型號的生物反應器與相應的瓶子與管道，分別校正4臺生物反應器的pH電極與DO電極，然后組裝好4臺生物反應器及相應瓶子與管道，裝上溫度電極，進行氣密性檢驗，合格后將組裝好的生物反應器121℃、30 min高壓滅菌。滅菌后將反應罐連接好，開啟反應器，分別加入滅菌后的微載體各1瓶，然后加入500 mL細胞培養(yǎng)液進行預熱培養(yǎng)，觀察無菌情況，確保無菌后備用。

1.4.2 轉瓶PK15細胞的消化 取10瓶15 L瓶培養(yǎng)狀態(tài)良好的單層PK15轉瓶細胞，用PBS洗2次，加0.25%胰酶進行消化，消化中止后每瓶加400~500 mL營養(yǎng)液，然后將細胞瓶用力旋轉搖甩，然后將10瓶消化后的細胞混合成一個轉瓶并搖勻，細胞搖勻后取少量細胞樣進行細胞計數(shù)。

1.4.3 接種前細胞計數(shù) 將轉瓶消化下來的細胞用細胞培養(yǎng)液按4~5倍的稀釋倍數(shù)進行稀釋，將稀釋后的細胞液加入細胞計數(shù)板中，在顯微鏡下進行計數(shù)，并根據(jù)細胞計數(shù)結果與稀釋倍數(shù)，換算轉瓶消化后的細胞密度。

1.4.4 細胞接種上罐 分別將4臺生物反應器進行編號，分別編為 A、B、C、D，四組生物反應器細胞接種密度分別按每個微載體20、30、40、50個細胞，并計算出每組反應器所需的細胞總數(shù)，將消化后的細胞根據(jù)細胞密度與不同組反應器所需的細胞總數(shù)，計算出每組反應器所需要的細胞體積，每克微載體的數(shù)量為4.3×106個，然后根據(jù)每組反應器需要的細胞體積，將轉瓶消化后混合的細胞分裝成相應的4瓶細胞，然后將4瓶細胞均加入60 mL種毒（接毒量為培養(yǎng)體積的3%），加入反應器罐中，用營養(yǎng)液補足至2 L。

1.4.5 細胞上罐后培養(yǎng)與取樣觀察 細胞上罐后設置好培養(yǎng)參數(shù)，如pH、DO、溫度、攪拌器轉數(shù)，開啟培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)至4 h分別進行取樣，在顯微鏡下觀察細胞的貼壁情況與細胞狀態(tài)。培養(yǎng)至24 h棄去每罐的培養(yǎng)液，重新加入新鮮的含2%血清的維持液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24 h換液前、培養(yǎng)48 h、培養(yǎng)72 h時進行取樣留樣，在顯微鏡下觀察不同時間細胞的生長情況與細胞狀態(tài)，并進行細胞計數(shù)。

1.4.6 微載體上的細胞計數(shù) 分別從4組留樣中各取1 mL含微載體的樣至1.5 mL的EP管中，靜置，等微載體沉淀后將上清液吸出，加入1 mL結晶紫，搖勻后置37℃培養(yǎng)箱中，30 min后充分震搖，培養(yǎng)至60 min時取出，充分震搖，然后按適當稀釋倍數(shù)進行稀釋，將稀釋后的樣吸出少量加至細胞計數(shù)板中進行計數(shù)。

1.4.7 抗原收獲與留樣 當細胞培養(yǎng)至72 h，每6 h觀察一次反應器PID曲線，并取樣觀察細胞脫落情況，當細胞脫落達70%時，將反應器的轉數(shù)提高至150 r/min，攪拌5 min，然后靜置3 min，通過管道收取反應器內的上清液，將每組反應器收獲的抗原分別取2 mL樣用于檢測抗原效價。

1.4.8 抗原效價的檢測 用間接免疫熒光法測定病毒效價，將4組反應器培養(yǎng)的抗原樣品，分別用剛消化好的測毒用細胞懸液進行10倍系列稀釋，每組均取10-4、10-5、10-6三個稀釋度稀釋后的病毒細胞液，分別加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度加6孔，100 μL/孔，同時設立陽性對照與陰性對照。培養(yǎng)24 h后換含3 mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 培養(yǎng)至48 h時進行細胞固定、加一抗與二抗孵育，然后在熒光顯微鏡下觀察，細胞對照孔應無熒光物質著染，而有綠色熒光物質著染的細胞孔判為PCV2感染陽性。統(tǒng)計各組每個稀釋度病毒接種細胞孔中PCV2陽性孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計算病毒TCID50，即抗原效價。

2 結果與分析

2.1 細胞貼壁4 h后的貼壁率與細胞狀態(tài) 從表1數(shù)據(jù)可知，B組與C組按每個微載體30、40個細胞量上罐的細胞貼壁率較高，而且細胞狀態(tài)較好，貼壁率可達90%以上，而A組與D組按每個微載體20、50個細胞量上罐的細胞貼壁率較低，同時細胞狀態(tài)也較差。

表1 各組反應器4 h的貼壁率與細胞狀態(tài)

2.2 各組反應器細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的細胞狀態(tài)與細胞增長情況 從表2數(shù)據(jù)可知，四組反應器培養(yǎng)至24~48 h的細胞狀態(tài)較好，至72 h后細胞狀態(tài)開始變差，同時四組反應器細胞在貼壁后開始增長，24 h增長倍數(shù)不高，培養(yǎng)48 h后增長倍數(shù)最高，72 h后細胞增長倍數(shù)開始下降，各時間段整體細胞狀態(tài)最好的是B組與C組，A組與D組的細胞狀態(tài)相對較差，在四組中各時間段細胞增長倍數(shù)最高的是C組，其次是B組，增長倍數(shù)最低的是A組。

2.3 收獲時間與最終抗原效價情況 從表3數(shù)據(jù)可知，C組收獲時的培養(yǎng)時間最長，達112 h，同時收獲的抗原效價也最高，達到107.5TCID50/mL，其次是B組，A組與D組收獲時的培養(yǎng)時間相對較短，同時收獲的抗原效價也相對較低，A組的效價最低，只達106.5TCID50/mL。

表3 不同組反應器的收獲時間與最終抗原效價

3 討 論

1）生物反應器微載體培養(yǎng)技術具有如下優(yōu)點：微載體的表面積與體積比增大，可在有限的空間里提供大量表面積，從而獲得密度較高的基質細胞；另外，采用該培養(yǎng)技術可自動化監(jiān)控細胞的生長情況，有效減少人力、物力、財力，能夠降低污染，尤其適合大規(guī)模批量生產[5]。由于生物反應器培養(yǎng)相對轉瓶培養(yǎng)具有較大的優(yōu)勢，所以，近幾年越來越多的疫苗企業(yè)開始研究生物反應器培養(yǎng)病毒工藝并應用于大生產，生物反應器培養(yǎng)病毒是生物制品行業(yè)未來的發(fā)展趨勢。

2）影響生物反應器生產的抗原效價因素很多，如細胞接種密度、接毒量、培養(yǎng)液pH、溶氧、溫度、收獲時間等，本課題組在轉瓶培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)細胞密度是影響抗原效價的一個重要因素，本試驗針對生物反應器的細胞接種密度進行了研究。

3）許多研究表明，細胞生長的最終密度分別與細胞的接種密度和微載體濃度有關[6]。本試驗表明細胞接種密度太低，細胞貼壁不均，貼壁率低，細胞增殖緩慢，生產的抗原效價低；細胞接種密度過大，同樣造成細胞貼壁不均，細胞增長不高，生產的抗原效價不高。章孟學等[7]研究也表明，細胞密度過大，可能會造成病毒吸附不均勻，導致病毒復制不均。

4）疫苗的抗原效價是決定成品免疫效果的一項重要因素，要提高疫苗免疫效果，提高產品銷量，打造產品的品牌，可利用生物反應器來培養(yǎng)病毒，優(yōu)化反應器培養(yǎng)工藝來提高抗原的效價，提高免疫效果。

影響抗原效價的因素很多，本試驗研究了反應器細胞的接種密度，對于反應器的接毒量、溶氧等其他因素還有待進一步研究。

表2 各組反應器培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后的細胞狀態(tài)與細胞增長情況

[1]張晶.同一個地球同一個圓環(huán)[J].豬業(yè)科學,2010(1)：58-62.

[2]王憲文,姚四新,劉興友,等.豬圓環(huán)病毒2型復制及其影響因素[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(3)：220-223.

[3]楊霞,高金良,陳陸,等.豬圓環(huán)病毒2型在轉管微載體培養(yǎng)PK-15細胞中增殖動態(tài)[J].中國預防獸醫(yī)學報,2015,37(2)：146-148.

[4]閃伊紅,王進產,郭麗霞,等.豬圓環(huán)病毒2型培養(yǎng)工藝研究[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2016,32(3)：56-57.

[5]井申榮.微載體制備甲肝滅活疫苗的研究[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學,2000.

[6]王佃亮,肖成祖,陳昭烈,等.微載體高密度培養(yǎng)Vero細胞的研究[J].生物工程學,1996,12(2)：164-170.

[7]章孟學,周健,楊耀云,等.生物反應器微載體系統(tǒng)培養(yǎng)Sabin株脊髓灰質炎病毒條件的優(yōu)化[J].中國生物制品學雜志,2017,30(5)：530-535.