俞春英 林 瑋 謝金東 王訓(xùn)立福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 福州 350122

福建黃兔是福建省獨(dú)有的家兔品種，是長(zhǎng)期的地理隔離演變來的。據(jù)報(bào)道，福建黃兔耐粗飼、繁殖率和成活率高，這對(duì)于在養(yǎng)殖業(yè)中難度較大的兔類飼養(yǎng)來講是極其有利的優(yōu)勢(shì)[1-3]。福建省連江玉華山兔場(chǎng)是我省福建黃兔的種源基地，該兔場(chǎng)繁殖生產(chǎn)的家兔屬于非等級(jí)實(shí)驗(yàn)兔，飼養(yǎng)于普通的開放環(huán)境，主要供肉用和當(dāng)?shù)馗叩仍盒５慕虒W(xué)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物。我校長(zhǎng)期教學(xué)用家兔主要來源于該兔場(chǎng)，鑒于該家兔為非等級(jí)實(shí)驗(yàn)兔，由于在教學(xué)用家兔的使用環(huán)節(jié)中存在多種可能發(fā)生的生物安全隱患，如學(xué)生偶爾被抓傷、咬傷，進(jìn)行采血、灌胃、解剖實(shí)驗(yàn)等，倘若發(fā)生具有危害性的病原體感染事故，將會(huì)嚴(yán)重影響到實(shí)驗(yàn)人員及學(xué)生的身體健康，甚至帶來局部的傳播。因此，動(dòng)物的微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)質(zhì)量控制與我們的實(shí)驗(yàn)環(huán)境安全和身體健康息息相關(guān)。為防范于未然，定期抽查我校所使用的教學(xué)實(shí)驗(yàn)用家兔的微生物和寄生蟲攜帶情況，以最大程度控制和避免教學(xué)生物安全事故的發(fā)生[4-6]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 福建省連江縣玉華山種兔場(chǎng)飼養(yǎng)的4月齡福建黃兔，四批次動(dòng)物按春、夏、秋、冬四個(gè)季度采樣，每季度隨機(jī)挑選25只，于我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(閩2014-0006)]適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，觀察無異常癥狀表現(xiàn)后進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)。

1.2 試劑及設(shè)備

1.2.1 細(xì)菌檢測(cè)試劑 SF培養(yǎng)基、NAC養(yǎng)基、高鹽甘露醇培養(yǎng)基、DHL培養(yǎng)基、血瓊脂平板、生化鑒定管購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；兔泰澤病原體抗體檢測(cè)試劑盒購自蘇州西山生物技術(shù)有限公司；戊巴比妥鈉由索萊寶生物科技有限公司分裝，批號(hào)為1014P034和701O034。

1.2.2 病毒檢測(cè)試劑 兔出血癥病毒檢測(cè)ELISA試劑盒購自Express BIO。

1.2.3 寄生蟲檢測(cè)試劑 弓形蟲間接血凝試驗(yàn) （I-HA）試劑購自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2.4 其他試劑 其他試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2.5 主要儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱（MIR-254，日本三洋）；生物光學(xué)顯微鏡（E100，尼康）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（ELX808，美國(guó)寶特）；洗板機(jī)（ELX50，美國(guó)寶特）；高壓滅菌鍋（MLS-3750，日本三洋）；超凈工作臺(tái) （SW-CJ-2FD，蘇州安泰）；電熱恒溫干燥箱（DHG-9053A，上海一恒）。

1.3 檢測(cè)程序 動(dòng)物→編號(hào)→外觀檢查 （正常）→皮膚取樣（體外寄生蟲檢查）→采血（分離血清，檢查病毒抗體和其他病原的抗體）→麻醉→無菌解剖→增菌分離培養(yǎng)→生化鑒定、血清學(xué)鑒定→結(jié)果判定。

1.4 寄生蟲檢測(cè)

1.4.1 體外寄生蟲檢測(cè) 依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18448.1-2001[7]，采用拔毛法，逐只在兔的體表如耳、背、腹股溝等體外寄生蟲易感部位拔取少量被毛，分別散放在載玻片上，用透明膠粘住，編號(hào)，記錄取樣部位，保存于4℃冰箱。為避免蟲體降解需2 d內(nèi)檢測(cè)完畢，所有玻片于顯微鏡下觀察，每一玻片重復(fù)觀察一次，并記錄結(jié)果。

1.4.2 體內(nèi)寄生蟲檢測(cè) 依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18448.2-2008[8]，清醒狀態(tài)采兔耳靜脈血，分離血清，按弓形蟲抗體、出血癥病毒抗體、泰澤病原體抗體檢測(cè)所需的血清量分裝，編號(hào)，-80℃凍存。使用購買的弓形蟲間接血凝試驗(yàn)（IHA試驗(yàn)）的凍干抗原，定性檢測(cè)兔血清中的弓形蟲抗體。檢測(cè)步驟：用微量加樣器在96孔有機(jī)玻璃反應(yīng)板的每孔中加稀釋液，每個(gè)樣品需加4孔稀釋液，同時(shí)設(shè)陽性血清、陰性血清、空白對(duì)照；加待檢血清、陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清；樣品稀釋至第3孔，對(duì)照血清均稀釋至第7孔；將診斷液搖勻后加入每個(gè)孔，然后將反應(yīng)板置微型振蕩器上振蕩1～2 min，取下反應(yīng)板，蓋上與板大小相近的玻璃罩，置37℃作用2～3 h后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：在陽性對(duì)照血清效價(jià)不低于1∶1 024，陰性對(duì)照血清除第1孔允許有前滯現(xiàn)象“+”，其余各孔均為“-”，稀釋液對(duì)照為“-”的前提下，對(duì)待檢血清進(jìn)行判定，待檢血清效價(jià)達(dá)到或超過1∶64判為陽性，否則為陰性。

另收集兔糞球，每只數(shù)粒，裝入自封袋，編號(hào)，4℃冰箱冷藏，采用漂浮法和沉淀法檢測(cè)糞便中的線蟲，一周內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.5 病毒檢測(cè) 依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T14926.21-2001[9]，采用ELISA試劑盒檢測(cè)兔出血癥病毒。操作步驟：1∶50稀釋血清樣本，同時(shí)每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目均設(shè)陽性病毒抗原孔及陰性對(duì)照抗原孔；一抗孵育，在已包被抗原的ELISA微孔條上標(biāo)上序號(hào)，再向ELISA微孔板中陽性病毒抗原孔及陰性對(duì)照抗原孔各加稀釋好的樣本及陰性、陽性對(duì)照，貼上封板膜，置37℃孵育45 min；洗板5次，吸水紙上拍干；每孔加入酶標(biāo)二抗，貼上封板膜，置37℃孵育45 min；洗板步驟同上；顯色，加入 ABTS酶底物，室溫反應(yīng)30 min；讀板，加入終止液反應(yīng)2 min，并在15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，測(cè)試波長(zhǎng)為405 nm。結(jié)果判定：陰性對(duì)照血清的抗原孔讀數(shù)減去對(duì)照抗原孔讀數(shù)必須＜0.250、陽性對(duì)照血清抗原孔減去對(duì)照抗原孔讀數(shù)必須≧0.600時(shí)，本次試驗(yàn)結(jié)果有效。樣本孔讀數(shù)OD值減去對(duì)照抗原孔OD值≧0.300時(shí)判為陽性，否則為陰性。

1.6 細(xì)菌檢測(cè) 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.1-2001[10]、GB/T 14926.5-2001[11]、GB/T 14926.14-2001[12]、GB/T 14926.17-2001[13]、GB/T 14926.10-2008[14]的方法，3%戊巴比妥鈉耳靜脈麻醉兔，在超凈臺(tái)上無菌解剖兔，挑取少量回盲部?jī)?nèi)容物分別接種SF增菌液、高鹽甘露醇培養(yǎng)基、NAC培養(yǎng)基，同時(shí)挑取少量氣管分泌物劃線接種血瓊脂平板，然后增菌分離培養(yǎng)，結(jié)合生化鑒定和血清學(xué)鑒定，分別檢測(cè)該種兔場(chǎng)兔的沙門氏菌、多殺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌感染情況。使用ELISA試劑盒檢測(cè)兔血清中泰澤病原體的抗體，步驟與兔出血癥病毒抗體檢測(cè)類似。

2 結(jié) 果

2.1 福建黃兔體內(nèi)外寄生蟲檢測(cè) 四批次家兔體內(nèi)寄生蟲檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說明該家兔群體沒有弓形蟲病原的感染，兔糞球中也未查到線蟲，但四批次均有不同程度的體外寄生蟲（螨蟲）感染，結(jié)果見表1。

表1 福建黃兔體外寄生蟲（節(jié)肢動(dòng)物）、弓形蟲、線蟲檢測(cè)結(jié)果

2.2 福建黃兔出血癥病毒檢測(cè) 該兔場(chǎng)有實(shí)施兔出血癥病毒的免疫程序，四批次福建黃兔的出血癥病毒抗體檢測(cè)均為陽性，表明經(jīng)過免疫的福建黃兔能很好地得到抗體的保護(hù)，避免感染出血癥病毒。結(jié)果見表2。

表2 福建黃兔出血癥病毒抗體的檢測(cè)結(jié)果

2.3 福建黃兔細(xì)菌學(xué)檢測(cè) 四批次共100只黃兔的細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該群體無沙門氏菌、多殺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、泰澤病原體的流行，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的普通級(jí)家兔的細(xì)菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，不存在普通級(jí)家兔所要排除的人畜共患病和動(dòng)物烈性傳染病病原體。但據(jù)悉該兔場(chǎng)有實(shí)施一定的細(xì)菌免疫程序，因此，還無法達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的不能免疫又必須陰性的要求，僅能作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物，結(jié)果見表3。

3 討 論

近幾年在高等院校發(fā)生了多起因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物所引發(fā)的教學(xué)生物安全事故，因此，在高校及科研院所的科研和教學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中提高生物安全意識(shí)，警惕生物安全事故的發(fā)生顯得極其重要。由于我省沒有正規(guī)的實(shí)驗(yàn)兔供應(yīng)機(jī)構(gòu)，所有標(biāo)準(zhǔn)等級(jí)的科研用兔均購自北京、上海等地，導(dǎo)致提高動(dòng)物成本和延長(zhǎng)供應(yīng)時(shí)限。我校每年教學(xué)兔用量達(dá)1 000只左右，教學(xué)兔用量大，而教學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物質(zhì)量要求不高，受制于教學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和使用的便利性，因此，該兔場(chǎng)繁殖生產(chǎn)的非等級(jí)福建黃兔就成為我校教學(xué)用家兔的主要供應(yīng)來源。目前，福建黃兔為非等級(jí)家兔，飼養(yǎng)于普通開放環(huán)境中，為了預(yù)防動(dòng)物疫病及防范教學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的生物安全事故，有必要了解該兔的微生物和寄生蟲流行情況，為此開展了該項(xiàng)調(diào)查研究。

由于微生物和寄生蟲的流行情況往往有季節(jié)性特點(diǎn)，為了全面了解不同季節(jié)該兔的微生物和寄生蟲感染情況，本試驗(yàn)按季度對(duì)兔場(chǎng)的生產(chǎn)繁殖群進(jìn)行抽檢采樣，參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中普通級(jí)家兔的檢測(cè)要求選擇檢測(cè)項(xiàng)目[15]，另增加多殺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、泰澤病原體項(xiàng)目。

結(jié)果表明，抽查的四批次福建黃兔未發(fā)現(xiàn)感染沙門氏菌、多殺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和泰澤病原體，每只兔都檢測(cè)到出血癥病毒保護(hù)抗體，100只福建黃兔均無弓形蟲感染，但體外寄生蟲螨蟲的平均檢出率達(dá)36%。由此可知，福建黃兔不存在人畜共患病和烈性傳染病的病原體感染，兔的健康狀況良好。但該兔場(chǎng)的兔體外寄生蟲如螨蟲的感染率較高，可能是因?yàn)轱曫B(yǎng)于普通環(huán)境，且該兔場(chǎng)生產(chǎn)的家兔大部分供作肉用，在飼養(yǎng)上未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中普通級(jí)家兔的飼養(yǎng)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)和飼養(yǎng)管理要求。此外，也不能排除兔在運(yùn)輸過程和飼養(yǎng)于我校動(dòng)物中心這一階段所帶來的微生物和寄生蟲感染的可能，因此，今后若進(jìn)行階段性的抽查，需到現(xiàn)場(chǎng)采樣以排除這一可能。螨蟲的存在雖不會(huì)對(duì)環(huán)境和人體造成致命性危害，但影響動(dòng)物的質(zhì)量和人的身體健康。而要消除螨蟲感染，需從凈化種群、凈化飼養(yǎng)環(huán)境和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理入手，但對(duì)于這類非等級(jí)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)供應(yīng)商的地方性養(yǎng)殖場(chǎng)而言是難以實(shí)現(xiàn)的。因此，要改變教學(xué)實(shí)驗(yàn)用家兔的現(xiàn)狀，首先，需從學(xué)校層面出發(fā)，提高教學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，購買標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于教學(xué)；其次，提高學(xué)校師生的生物安全意識(shí)，培養(yǎng)學(xué)生的規(guī)范操作技能和習(xí)慣；最后，學(xué)校需要制定相應(yīng)的應(yīng)急預(yù)案，從而最大程度避免教學(xué)生物安全事故的發(fā)生，以保障實(shí)驗(yàn)環(huán)境不被致病性生物污染、師生健康不受傷害[16]。

表3 福建黃兔細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果

[1]張愛華.淺談福建黃毛兔[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2004,23(6)：41.

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[7]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 18448.1-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體外寄生蟲檢測(cè)方法[S].2001.

[8]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 18448.2-2008實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 弓形蟲檢測(cè)方法[S].2008.

[9]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T14926.21-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 兔出血癥病毒檢測(cè)方法[S].2001.

[10]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T14926.1-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 沙門菌檢測(cè)方法[S].2001.

[11]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T14926.5-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 多殺巴斯德桿菌檢測(cè)方法[S].2001.

[12]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T14926.14-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法[S].2001.

[13]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T14926.17-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 綠膿桿菌檢測(cè)方法[S].2001.

[14]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T14926.10-2008實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 泰澤病原體檢測(cè)方法[S].2008.

[15]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T14922.2-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物等級(jí)及監(jiān)測(cè)[S].2001.

[16]張慧儉,張娜.中醫(yī)院校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物安全教育現(xiàn)狀及對(duì)策[J].中國(guó)科技創(chuàng)新導(dǎo)刊,2013(32)：82.