盧富山，尹清強(qiáng)，趙衛(wèi)衛(wèi)，王 瀟

(1.河南普愛飼料股份有限公司，河南 周口 466100；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)具備免疫調(diào)節(jié)、抑制病原微生物、維持腸道菌群平衡和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等很多保健作用[1]。植物乳桿菌微生態(tài)制劑的制備，關(guān)鍵技術(shù)就是高密度培養(yǎng)，限制乳酸菌增殖的關(guān)鍵因素是有機(jī)酸的積累和發(fā)酵底物的消耗。在發(fā)酵進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，乳酸以及其他有機(jī)酸的生成導(dǎo)致pH的下降，在pH降為4.0左右時(shí)，就會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，這時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞繁殖就會(huì)被破壞[2]；同時(shí)，底物的大量消耗也限制了微生物的持續(xù)增長(zhǎng)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)能夠有效中和過(guò)多的酸并補(bǔ)充缺失的營(yíng)養(yǎng)素，在流加補(bǔ)料液的過(guò)程中，通過(guò)應(yīng)用低濃度初糖并且在發(fā)酵過(guò)程中連續(xù)補(bǔ)料[3]和調(diào)整至最適pH值，使菌體數(shù)量在發(fā)酵結(jié)束時(shí)能夠獲得很大提高，對(duì)乳酸菌進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)具有一定的指導(dǎo)意義[4-5]。本研究對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)，找出培養(yǎng)過(guò)程中有效的限制性營(yíng)養(yǎng)因子[6]和最優(yōu)調(diào)整pH方式，以此獲得高密度細(xì)胞培養(yǎng)方法，解決植物乳桿菌發(fā)酵劑制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 植物乳酸桿菌(L.plantarum)CICC 20265，購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基(MRS)：葡萄糖2%、胰蛋白胨1%、牛肉蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、NaAc 0.5%、K2HPO40.2%、MgSO40.058%、MnSO40.025%、檸檬酸二胺0.2%、吐溫80為0.1 mL、pH為6.2～6.4。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、胰蛋白胨1.4%、NaCl 0.25%、MgSO40.1%、K2HPO40.5%、NaAc 0.3%。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 接種凍干保藏的菌種于種子培養(yǎng)基，于37 ℃靜止培養(yǎng)18 h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將制備的種子液按照1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃靜止培養(yǎng)18 h，即為后續(xù)試驗(yàn)用發(fā)酵液。

1.2.3 分批補(bǔ)料式高密度培養(yǎng)[7]乳酸菌在37 ℃下培養(yǎng)至12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度在5 g/L左右。然后在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采用不同的分批補(bǔ)料手段向發(fā)酵液中添加新鮮的補(bǔ)料液，同時(shí)添加堿液保持pH值為6.5。

首先在500 mL培養(yǎng)瓶中裝入200 mL發(fā)酵液，對(duì)乳酸菌進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)研究，探討對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期限制微生物生長(zhǎng)的限制性底物，以活菌數(shù)為參照，研究補(bǔ)料時(shí)的最適中和劑和補(bǔ)料液的最佳碳氮比。

在發(fā)酵12 h后，向發(fā)酵液中分別加入不同配比的補(bǔ)料液，通過(guò)測(cè)定補(bǔ)料后活菌數(shù)的變化，研究限制微生物增殖的營(yíng)養(yǎng)要素以及發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮源最佳配比。將發(fā)酵培養(yǎng)基按照營(yíng)養(yǎng)組分為2組：葡萄糖(L1,30 g/L)和蛋白胨(L2，28 g/L)。

在發(fā)酵12 h后，分別選擇1 mol/L的KOH、Na2CO3溶液、氨水和醋酸鈉為中和劑，調(diào)解pH到最適，最終通過(guò)測(cè)定活菌數(shù)選擇最佳的中和劑。

在確定補(bǔ)料液最佳碳氮比和最適中和劑后，進(jìn)行10 L發(fā)酵罐擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用恒速流加、葡萄糖反饋流加等補(bǔ)料方式，將碳氮比為5∶7的補(bǔ)料液注入發(fā)酵罐并同時(shí)調(diào)整pH值，通過(guò)測(cè)定活菌數(shù)的變化，探究最佳分批補(bǔ)料方式。

1.2.4 活菌計(jì)數(shù)方法 將發(fā)酸液按10的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，取1 mL稀釋液涂布于的固體培養(yǎng)基上，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，計(jì)算發(fā)酵液中活菌數(shù)(CFU/mL)，并用自然對(duì)數(shù)(lg)表示。

1.2.5 pH值的測(cè)定 采用PHS-3C精密酸度計(jì)直接測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

1.2.6 還原糖的測(cè)定 采用DNS法。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始葡萄糖濃度對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響

由表1可知：葡萄糖質(zhì)量濃度在5～15 g/L范圍內(nèi)，菌體濃度隨初糖質(zhì)量濃度增大而增加；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)，菌體濃度最大；初始糖濃度繼續(xù)增加，菌體濃度降低。由此可以看出在一定范圍內(nèi)，增加初始糖質(zhì)量濃度可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，但過(guò)高的底物濃度反而抑制了細(xì)胞的增殖。

Combining the mathematical model defined by Eqs.(1)–(3),the transfer function of the hydraulic section is

2.2 起始氮源濃度對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響

配制不同蛋白胨含量的培養(yǎng)基，含量分別為6、10、14、16、18 g/L，其他成分相同，裝液量100/250 mL，接種量3%，培養(yǎng)24 h后測(cè)活菌數(shù)。

表1 不同初糖濃度對(duì)活菌數(shù)的影響

由表2可以看出，14、16、18 g/L下的活菌數(shù)差異不明顯，但14 g/L下的活菌數(shù)最高，用量也較少，確定氮源初始濃度為14 g/L。

表2 不同氮源濃度對(duì)活菌數(shù)的影響

2.3 最適pH的確定

將液體培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，37 ℃下恒溫培養(yǎng)18 h后，檢測(cè)其活菌數(shù)。由表3可以看出，發(fā)酵液初始pH為7.0～7.5時(shí)活菌數(shù)最高。

表3 不同初始pH對(duì)活菌數(shù)的影響

2.4 限制性底物的確定

補(bǔ)料分批培養(yǎng)首先要確定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期限制微生物增殖的營(yíng)養(yǎng)因子。由圖1可知，在微生物生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，菌體OD值達(dá)到0.2976，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度降至2 g/L，表明葡萄糖的損耗可能是限制微生物繼續(xù)增殖的因素。

微生物的增殖需要多種營(yíng)養(yǎng)因子，那么培養(yǎng)基到對(duì)數(shù)末期可能還存在其他限制性營(yíng)養(yǎng)因子。因此本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了3種補(bǔ)料液，分別為補(bǔ)料液L1(10 mL)、補(bǔ)料液L2(10 mL)、補(bǔ)料液L1(5 mL)+ L2(5 mL)，在分批培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期(12 h)，將上述補(bǔ)料液分別一次性加入200 mL的發(fā)酵培養(yǎng)液，在補(bǔ)料培養(yǎng)階段調(diào)節(jié)pH值在7左右，培養(yǎng)22 h后結(jié)束發(fā)酵，測(cè)得其活菌數(shù)變化(表4)。

在發(fā)酵平穩(wěn)期加入補(bǔ)料液L1，22 h后菌體濃度增加，這表明分批培養(yǎng)末期的細(xì)胞增殖停止是由碳源匱乏引起的。當(dāng)補(bǔ)料液中含有氮源時(shí)(L2及L1+L2)，菌體總量有所增加，這表明氮源也是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的限制性營(yíng)養(yǎng)因子，需要在分批補(bǔ)料過(guò)程中加入補(bǔ)料液。

圖1 植物乳酸桿菌生長(zhǎng)過(guò)程變化表4 不同補(bǔ)料類型對(duì)活菌數(shù)的影響

補(bǔ)料類型終pH活菌數(shù)/(CFU/mL)L14.719.18±0.012 BL27.048.79±0.13 CL1+L24.659.30±0.03 AB空白3.778.57±0.06 C

注：空白表示未進(jìn)行補(bǔ)料。

2.5 補(bǔ)料液最適碳氮比的確定

在補(bǔ)料液中，葡萄糖(L1)添加量不變(5 mL)，增加蛋白胨的添加量。在前4組實(shí)驗(yàn)中，隨著蛋白胨添加量的增加，活菌數(shù)也隨之提高，并且差異顯著。這主要是由于補(bǔ)料液中蛋白胨含量較少。當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿?L2)增加到7 mL時(shí)，獲得了最大的活菌數(shù)；繼續(xù)增加蛋白胨則活菌數(shù)趨于穩(wěn)定且差異不顯著，此時(shí)可能葡萄糖的缺乏又成為關(guān)鍵因素。所以在補(bǔ)料試驗(yàn)中，確定補(bǔ)料液中的C/N(體積比)為5∶7。

表5 不同碳氮比的補(bǔ)料液對(duì)活菌數(shù)的影響

2.6 中和劑的選擇

在乳酸桿菌高密度培養(yǎng)過(guò)程中往往通過(guò)流加堿液來(lái)消除酸的反饋抑制[7]。本實(shí)驗(yàn)選擇KOH、Na2CO3溶液、氨水和醋酸鈉為中和劑，按確定的適宜條件進(jìn)行發(fā)酵，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期一次性補(bǔ)料的同時(shí)選用不同的中和劑調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值到7，并比較不同中和劑對(duì)植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的影響，中和劑的濃度為1 mol/L，測(cè)定培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)。

在乳酸菌的靜止培養(yǎng)過(guò)程中，大量乳酸以及其它有機(jī)酸積累會(huì)對(duì)細(xì)胞的分裂增殖產(chǎn)生反饋抑制[8]。植物乳桿菌在高密度培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，在培養(yǎng)過(guò)程中加入中和劑后，氫氧化鈉能快速恢復(fù)降低的pH值，醋酸鈉作為緩沖劑能穩(wěn)定發(fā)酵液的pH值。綜上，試驗(yàn)確定氫氧化鈉+醋酸鈉為最適中和劑(表6)。

表6 不同中和劑對(duì)活菌數(shù)的影響

2.7 最適補(bǔ)料方式的確定

首先應(yīng)用恒速補(bǔ)料策略進(jìn)行高密度培養(yǎng)，以2 g/(L·h)(以葡萄糖計(jì)) 的補(bǔ)料速度向發(fā)酵液中加入C/N為5∶7 (體積比)的補(bǔ)料液，同時(shí)每隔2 h調(diào)節(jié)一次pH值至7。

葡萄糖反饋補(bǔ)料策略：通過(guò)對(duì)補(bǔ)料液補(bǔ)料速度的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)施葡萄糖反饋補(bǔ)料控制，根據(jù)培養(yǎng)液內(nèi)的葡萄糖濃度的變化及時(shí)調(diào)整葡萄糖添加量，使葡萄糖濃度維持在一個(gè)合適的范圍內(nèi)。雖然確定殘?zhí)堑馁|(zhì)量濃度需要1 h的間隔時(shí)間，但可以粗略地保持一個(gè)所需的低殘?zhí)琴|(zhì)量濃度(1.0～1.5 g/L)，在該條件下，培養(yǎng)24 h。

由圖2可知，葡萄糖反饋流加效果最好，活菌濃度能達(dá)到3.1×109CFU/mL；而恒速流加能達(dá)到2.4×109CFU/mL；兩種流加培養(yǎng)方式[9-10]的活菌數(shù)都高于靜止培養(yǎng)。葡萄糖反饋流加是將發(fā)酵過(guò)程中的葡萄糖濃度控制在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵液中碳氮源、pH值在最適水平，有利于微生物細(xì)胞的增殖；而恒速流加能夠在發(fā)酵前期提供給乳酸菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)要素，到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，微生物生長(zhǎng)迅速，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗速度已經(jīng)大于補(bǔ)料速度，后期則不能滿足菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。因此，葡萄糖反饋流加方法更適合植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)。

圖2 不同補(bǔ)料方式下活菌數(shù)的變化

3 討論

本研究首先確定了補(bǔ)料液的組分與配比，確定了最佳的中和劑組合模式。通過(guò)流加不同組分、不同配比的補(bǔ)料液，發(fā)現(xiàn)碳源(葡萄糖)和氮源(蛋白胨)是植物乳桿菌增殖的限制性底物，從而確定了葡萄糖和蛋白胨混合物為補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中需要補(bǔ)加的營(yíng)養(yǎng)素，并在此基礎(chǔ)上確定了補(bǔ)料液的最優(yōu)碳氮比5∶7。同時(shí)，乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中不斷代謝糖類產(chǎn)生乳酸和其他有機(jī)酸，使得培養(yǎng)液酸度不斷增加，乳酸菌的生長(zhǎng)受到低pH值的抑制，因此在補(bǔ)料同時(shí)向培養(yǎng)基中加入中和劑來(lái)調(diào)解pH值，使用緩沖劑來(lái)維持pH值在一定范圍內(nèi)，最終選用氫氧化鈉和醋酸鈉組合為最優(yōu)中和劑。

為了研究更好的補(bǔ)料分批高密度培養(yǎng)法，本研究比較了2種流加模式，恒速流加模式雖然能夠平穩(wěn)地向培養(yǎng)液中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)要素，在前期一定程度上滿足了微生物的營(yíng)養(yǎng)需求，但到了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期細(xì)胞增殖迅速，恒速流加就無(wú)法滿足細(xì)胞增殖的營(yíng)養(yǎng)需求，因此會(huì)限制菌體的快速生長(zhǎng)。葡萄糖反饋補(bǔ)料被證實(shí)為最佳的，這種流加方式能將發(fā)酵液中葡萄糖控制在一定的范圍內(nèi)，并且通過(guò)內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)需求調(diào)整營(yíng)養(yǎng)要素供給量，所以最終獲得了較高的細(xì)胞濃度，活菌數(shù)達(dá)到3.1×109CFU/mL，最終使用葡萄糖反饋流加可以使活菌數(shù)提高4倍。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張敏,黃星原.病毒性心肌炎小鼠血清CAM21和TNF2-t的變化及意義[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2006,27(1):21-23.

[2] 金雙喜,韓羿斌.一株植物乳酸桿菌的高密度發(fā)酵[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2008,20(4):365-366,368.

[3] 靳志強(qiáng),李平蘭.補(bǔ)料分批法高密度培養(yǎng)德氏乳桿菌保加利亞亞種S-1[J].中國(guó)乳品工業(yè),2007,35(1):4-9.

[4] Riesen B D, Guthke R. High cell density cultivation of microorganisms [J]. Appl Microbiol Biotecho1, 1999(51): 422-430.

[5] 任亞妮,車振明,黃莉.乳酸菌發(fā)酵劑中的細(xì)胞高密度培養(yǎng)條件及最佳離心條件探索[J].中國(guó)調(diào)味品,2011,36(5):36-39.

[6] Furie M B, Tancinco M C, Smith C W. Monoclonal antibodies to leukocyte integrins cd11a/cd18 and cd11b/cd18 or intercellular adhesion molecule-1 inhibit chemoattractant-stimulated neutrophil transendothelial migration in vitro[J]. Blood, 1991, 78(8): 2089-2097.

[7] 王海娟,韓雪,馬微,等.高滲條件下相容性溶質(zhì)對(duì)乳酸桿菌的作用[J].食品科技,2015(3):16-19.

[8] 劉輝,季海峰,王四新,等.飼用乳酸菌高密度培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)飼料,2016(4):11-14.

[9] 徐慶陽(yáng),馬雷,程立坤,等.葡萄糖流加方式對(duì)黃色短桿菌生產(chǎn)L-亮氨酸的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010(8):1-5.

[10] Beom S K, Seung C L, Sang Y L, et al. High cell density fed batch cultivation ofEscherichiacoilusing exponential feeding combined with pH-state[J]. Bioprocess Bio-systems Engineering, 2004(26): 147-150.