潘美紅，楊海峰，惠林沖，薛 萍，繆美華，陳 微，何林玉，陳振泰

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

洋蔥產(chǎn)業(yè)是一個(gè)效益顯著的產(chǎn)業(yè)，有利于農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，不僅能滿足國內(nèi)市場(chǎng)需求，也為我國出口創(chuàng)匯做出重要貢獻(xiàn)，目前我國的洋蔥種植面積和產(chǎn)量已成為世界上的第一大國[1]。雖然洋蔥在我國蔬菜生產(chǎn)中占重要地位，但是由于我國洋蔥品種資源匱乏，育種單位少[2]，科研投入不足，生產(chǎn)上嚴(yán)重缺少有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的洋蔥品種，特別是雜交品種。洋蔥為異花授粉作物，花器官很小，難以開展常規(guī)人工雜交育種，國內(nèi)對(duì)洋蔥雄性不育的研究起步比較晚，選育出的洋蔥雜交品種質(zhì)量與國外品種存在一定差距，真正應(yīng)用于市場(chǎng)的很少[3]。利用洋蔥雄性不育系是進(jìn)行雜交品種選育和制種的關(guān)鍵，大部分從事洋蔥育種的工作者都致力于洋蔥雄性不育系的選育。本研究旨在對(duì)田間觀察到的洋蔥不育植株，利用分子標(biāo)記方法進(jìn)行育性鑒定，確定其不育性及不育類型，然后通過組培擴(kuò)繁不育系，為選育洋蔥雜交品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料概況

連蔥15號(hào)由連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育，中早熟品種，商品性好，外皮金黃色，內(nèi)部鱗片白色，有甜味，球形指數(shù)0.85，假莖較細(xì)；單球重330 g，黃淮地區(qū)9月5～10日播種，11月初定值，次年5月上旬開始采收，產(chǎn)量5400～5900 kg/667 m2，抗病性強(qiáng)。

1.2 不育株的鑒定

1.2.1 田間鑒定 洋蔥開花期，在連蔥15號(hào)種植群體中尋找符合洋蔥不育株表觀特征的植株，將不育株選擇其中一個(gè)花球套袋自交(保證花球上沒有開放的小花)，觀察自交結(jié)實(shí)情況。

1.2.2 分子標(biāo)記鑒定

1.2.2.1 DNA提取 試驗(yàn)材料在連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院東辛農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)基地種植，開花期在連蔥15號(hào)群體中找到3株不育株，另選3株可育株作對(duì)照，每株取2個(gè)花薹上的1片嫩葉，液氮冷凍研磨，用天根生物有限公司的DNA提取試劑盒(型號(hào)：DP350-03)提取DNA，取2 μL樣品于Nanodrop 2000 C微量分光光度計(jì)上進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測(cè)。

1.2.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 引物參考Kim等[4]報(bào)道的orf725，由蘇州金唯智生物有限公司合成：

正向引物序列(5′-3′):

F1-CATAGGCGGGCTCACAGGAATA。

反向引物序列(5′-3′):

R1-AATCCTAGTGTCCGGGGTTTCT，

R2-CAGCGAACTTTCATTCTTTCGC。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增試劑購置于TAKARA公司，反應(yīng)體系為25 μL，包括：2 μL DNA(0.1 μg)，2.5 μL 10×PCR buffer，1.25 μL(10 μmol/L)正向引物，1.25 μL(10 μmol/L)反向引物，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.25 μL TaqM和15.8 mL ddH2O，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min[5]，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 不育株組培擴(kuò)繁

1.3.1 組培方法篩選 參照陳振泰等[6]的組培方法，加引用文獻(xiàn)利用同品種可育株，進(jìn)行培養(yǎng)基配方的篩選，再應(yīng)用于不育株的組培。

表1 培養(yǎng)基成分及配比

注：MS為通用培養(yǎng)基代號(hào)，培養(yǎng)基pH為5.8，瓊脂8 g/L，蔗糖30 g/L。

1.3.2 組培苗倍性鑒定 將擴(kuò)繁得到的洋蔥單株壯苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2MS+1 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20～25 ℃。當(dāng)組培苗根長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，隨機(jī)選幾根生長(zhǎng)健壯的根，取2～3 mm根尖制作壓片[7]，在顯微鏡下觀察根尖染色體的有絲分裂情況。

1.3.3 組培苗生根、馴化移栽 洋蔥生根培養(yǎng)后，打開培養(yǎng)器皿的封口，放置1～2 d后，將洋蔥苗從培養(yǎng)器皿中取出，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移入裝有沙土的盆中，于自然光照條件下，白天22～25 ℃、夜間11～15 ℃的條件下培養(yǎng)，待洋蔥苗成活后移栽至大田。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥植株不育性鑒定結(jié)果

2.1.1 不育株表型鑒定 不育株剛開的花花藥顏色呈透明狀、顏色略帶綠色；開花后期與可育株相比，花藥干枯萎縮嚴(yán)重(圖1)；用手觸碰花球，無花粉沾手。開花前套袋自交，成熟后經(jīng)檢查完全不結(jié)實(shí)。

圖1 洋蔥可育株與不育株花球?qū)Ρ?/p>

2.1.2 不育株分子鑒定 根據(jù)Kim等[4]的報(bào)道，采用orf725標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠在可育株中擴(kuò)增出一條833 bp，T型不育中擴(kuò)增出833 bp和628 bp兩條帶，S型不育中只能擴(kuò)增出628 bp單一條帶。本試驗(yàn)結(jié)果如圖2，CK為希望之星正?？捎辏珹為希望之星不育株，3個(gè)CK都擴(kuò)增出833 bp條帶，3個(gè)不育材料都擴(kuò)增出833 bp和628 bp兩個(gè)條帶，可以確定田間觀察到的洋蔥為不育株，且是CMS-T型不育。

2.2 洋蔥不育株組織培養(yǎng)

采用鱗莖盤做外植體，采用MS培養(yǎng)基，配以一定比例的6-BA和NAA，不誘導(dǎo)愈傷組織，只誘導(dǎo)不定芽。由表2可知，每一種培養(yǎng)基都有超過70%的誘導(dǎo)率，采用M65、M74配方的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率達(dá)到了100%。比較平均每個(gè)鱗莖盤誘導(dǎo)不定芽數(shù)發(fā)現(xiàn)，該洋蔥品種在M74的培養(yǎng)基上平均每個(gè)鱗莖盤有3個(gè)不定芽，誘導(dǎo)效果明顯高于其他培養(yǎng)基。最終確定用M74，即MS+7 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA培養(yǎng)基進(jìn)行不育株的擴(kuò)繁。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果表2 洋蔥在不同培養(yǎng)基上的增殖效果

培養(yǎng)基編號(hào)鱗莖盤總數(shù)誘導(dǎo)率/%每鱗莖盤不定芽數(shù)/個(gè)M413076.70.767 DEM423073.30.767 DEM433076.70.833 DEM442979.30.862 DEM453076.70.767 DEM463076.70.833 DEM512989.71.100 BCDEM523076.71.070 CDEM533080.01.130 BCDEM542989.70.931 CDEM552871.40.750 DEM563063.30.667 EM612889.31.290 BCDEM623086.71.200 BCDEM633083.31.370 BCDM642996.61.340 BCDM6529100.01.550 BCM662896.41.290 BCDEM712777.80.852 DEM722885.71.250 BCDEM732996.61.720 BM7430100.03.030 AM752993.11.340 BCDM763096.71.230 BCDE

2.3 再生植株的倍性鑒定

將所獲得的不定芽從鱗莖盤切下，轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中，7～10 d后發(fā)育成正常植株，再將該植株轉(zhuǎn)入1/2MS+1 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA培養(yǎng)基中生根，20 d左右生根，對(duì)所獲得的再生植株進(jìn)行根尖染色體數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)繁所得的洋蔥不育株含2n=2x=16條染色體(圖3)。

3 討論

利用雄性不育系配制雜種一代是蔬菜雜交優(yōu)勢(shì)利用的主要育種途徑，洋蔥也是最早利用雄性不育系育種的蔬菜之一[8]，但是由于洋蔥兩年生，3年1個(gè)世代，采用傳統(tǒng)育種方法選育洋蔥雄性不育系時(shí)間太長(zhǎng)。國外對(duì)洋蔥雄性不育的研究較早較深入，目前中國市場(chǎng)上的洋蔥雜交品種也多從國外引進(jìn)，我國缺乏具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的洋蔥雜交品種瓶頸在于洋蔥不育系的選育。國內(nèi)外利用分子標(biāo)記進(jìn)行洋蔥雄性育性的相關(guān)研究已有不少報(bào)道[4,9-20]，通過試驗(yàn)比較，采用orf725標(biāo)記，不僅能快速鑒定出洋蔥育性，還能區(qū)分出洋蔥不育類型，方法簡(jiǎn)單實(shí)用而經(jīng)濟(jì)。利用組培，能快速擴(kuò)繁不育株，但是對(duì)于不同類型的洋蔥，不同配方的培養(yǎng)基，增殖效果不盡相同，本試驗(yàn)條件下，連蔥15號(hào)以洋蔥鱗莖盤為外植體，含有7 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基增殖效果最好，通過染色體計(jì)數(shù)分析，洋蔥組培苗的倍性不變。分子標(biāo)記與組織培養(yǎng)兩者有效結(jié)合，能快速培育出不育系，為雜交種的選育提供材料。

圖3 再生洋蔥植株根尖細(xì)胞有絲分裂

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