（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007）

草魚（Grass carp,Ctenopharyngodon idellus)是我國(guó)的四大家魚之一，作為一種草食性魚類，草魚價(jià)格便宜，養(yǎng)殖飼料便于購(gòu)買，對(duì)養(yǎng)殖地域的要求不嚴(yán)格，是我國(guó)淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的魚類之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。雖然草魚的經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高，但是其病害也多，其中草魚病毒性出血病為公認(rèn)的危害草魚養(yǎng)殖最嚴(yán)重的疾病，它給水產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的損失[1]。

草魚出血病傳染率高，致病性強(qiáng)，流行范圍廣，在廣西、廣東、江蘇、湖南和湖北等地區(qū)都有流行，死亡率高達(dá)80%[2]。青魚、稀有鮈鯽和麥穗魚等水生動(dòng)物也能被此病毒感染[3,4]，因此草魚呼腸孤病毒引起的草魚出血病的防治工作非常困難。1972年首次報(bào)道此病，1978年確定為病毒病[5]，1980年首次在病魚的腎組織及頭腎組織超薄切片中觀察到呈晶格狀排列的病毒顆粒[6]，1983年，陳燕燊等將病毒分離，從病魚組織里獲取到的濾液，去感染草魚，得到典型的出血癥狀，病毒在細(xì)胞中能夠進(jìn)行傳代繁殖，對(duì)病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和理化特性的研究，測(cè)得該病毒核酸為雙股RNA[7]。故將其定名為草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)。草魚呼腸孤病毒屬于呼腸孤病毒科，水生呼腸孤病毒屬。該病毒嚴(yán)重影響一些亞洲國(guó)家（如中國(guó)、朝鮮、越南）的淡水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，重點(diǎn)體現(xiàn)在主要品種草魚在魚種階段經(jīng)常發(fā)生草魚出血病。此病毒流行范圍廣、危害程度大、死亡率高、發(fā)病季節(jié)長(zhǎng)，嚴(yán)重危害各地漁業(yè)的正常發(fā)展[8,9]。病毒形狀為二十面體的球型顆粒，其直徑為70-80 nm，具有雙層衣殼，無囊膜結(jié)構(gòu)。主要成分為蛋白質(zhì)和核酸，還含有少量的糖類，以糖蛋白的形式存在，不含脂類[9]。病毒基因組為雙鏈RNA，基因組由11個(gè)基因節(jié)段組成，表示為S1-S11[10]。

本實(shí)驗(yàn)選取的NS79蛋白是由草魚呼腸孤病毒GCRV-HN14株S4節(jié)段編碼的蛋白[11]。就目前而言，尚沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道NS79蛋白在病毒感染中的作用，因而其實(shí)際功能仍不清楚。而Ⅱ型草魚呼腸孤病毒作為目前國(guó)內(nèi)分布最廣、流行最為嚴(yán)重、致病力最強(qiáng)的草魚呼腸孤病毒，NS79蛋白很可能與其所特有的一些生物學(xué)特性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)草魚呼腸孤病毒NS79基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及多克隆抗體的構(gòu)建，以用于后期對(duì)該基因的功能及其致病相關(guān)性的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

毒株和載體：毒株GCRV-HN14來自本實(shí)驗(yàn)室分離，大腸桿菌E.coliDH5α和BL21(DE3)、原核表達(dá)載體 pET-32a（+）。

主要試劑：瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒、Taq酶、DL2000 DNA marker、蛋白 marker。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 從被感染GCRV-HN14病毒的魚體內(nèi)提取總RNA

取感染GCRV-HN14病毒的草魚，取草魚鰓組織0.2 g，加入1 ml PBS(磷酸緩沖鹽溶液）進(jìn)行充分研磨，取約 100 μl，加入 1 ml Trizol，按操作說明進(jìn)行總RNA的提取，提取的總RNA，溶于20μl DEPC處理水中。

1.2.2 病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄

取總 RNA 4 μl，94℃，5 min 打開病毒 RNA 雙鏈，然后加入特異性引物 NS79-32a F：5‘-GATGAATTCAAGGCTCTATGCTCAT’3 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，42℃延伸1 h。

1.2.3 NS79基因PCR的擴(kuò)增和鑒定

根據(jù)草魚呼腸孤病毒NS79基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)帶特異性酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增NS79 C端471 bp的序列，上游引物為NS79E-32aF，前端加入了EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物：TAAGCGGCCGCCTAATGGCCTGAGTCGTAGAAC，加入了NotI酶切位點(diǎn)。在PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因片段。反應(yīng)體系：PCR 反應(yīng)總體積為 25 μl，Buffer 2.5 μl，dNTP 1 μl，正向引物 0.5 μl，反向引物 0.5 μl，Taq 酶 0.5 μl，DNA 模板 1 μl，水 19 μl。 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性時(shí)間 35 s，53℃退火時(shí)間 30 s，72℃延伸時(shí)間1 min，35個(gè)循環(huán)后，于72℃延伸時(shí)間10 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 重組質(zhì)粒NS79E-pET-32a的構(gòu)建及鑒定

在凝膠成像儀中切下含有目的基因的DNA條帶，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收。以EcoRI和NotI對(duì)目的基因及原核質(zhì)粒載體pET-32a進(jìn)行雙酶切,酶切后的目的基因片段和載體片段進(jìn)行DNA回收，T4 DNA連接酶將目的基因NS79和pET-32a載體連接成重組質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌細(xì)胞，涂布在含有Amp的LB平板上，挑取培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基，于37℃溫箱中過夜培養(yǎng)。PCR檢測(cè)挑取的擴(kuò)大培養(yǎng)的菌落，將陽性克隆菌落送測(cè)序，檢測(cè)目的基因序列及連接的正確性。對(duì)測(cè)序正確的陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng)，質(zhì)粒小量提試劑盒提取重組質(zhì)粒NS79E-32a，雙酶切驗(yàn)證。

1.2.5 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒NS79E-32a轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21（DE3）大腸桿菌細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α相同，對(duì)挑取的菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽性菌接種100 ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌體OD600吸光度值為0.4-0.6時(shí)，添加IPTG至終濃度為1.0 mM誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，37℃，6 h后，分別取誘導(dǎo)前后菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。對(duì)大量誘導(dǎo)的菌體，離心收集菌體沉淀，用20 mL的結(jié)合緩沖液（2.4 g Tris，29.2 g NaCl，0.34 g 咪唑，溶解于蒸餾水至1000 mL，調(diào)pH7.9）重懸沉淀，超聲破碎 1h，收集沉淀用含6 M尿素的結(jié)合緩沖液10 ml過夜冰上溶解，溶解上清加入到Ni-IDA-Sefinose(TM)Resin柱，柱體積為1 ml，吸附重組蛋白。待上清流完后用10倍柱體積的含6 M尿素的結(jié)合緩沖液洗脫未結(jié)合在柱上的蛋白。用含不同濃度咪唑的洗脫緩沖液（2.4 g Tris，29.2 g NaCl，360 g 尿素，溶解于蒸餾水至1000 mL，其中咪唑濃度分別為20 mM、40 mM、60 mM、100 mM和500 mM。）SDS-PAGE檢測(cè)各洗脫液中重組蛋白的純度，將含高濃度重組蛋白的洗脫液進(jìn)行透析復(fù)性，將得到重組的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.6 NS79蛋白多克隆抗體的制備

將純化的重組蛋白與佐劑按1∶1的進(jìn)行混合，對(duì)重組蛋白進(jìn)行乳化，經(jīng)皮下六點(diǎn)注射對(duì)1只新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，在第1、2、3及4周各免疫1次，每次免疫的抗原量約100 μg，于第4周耳緣靜脈采血，分離血清。

1.2.7 血清抗體效價(jià)的檢測(cè)

用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。將純化的重組蛋白作為抗原和包被液混合后包被到96孔板上，每孔5 μg，4℃過夜孵育，PBST（pH7.4）洗滌 3 次，加入牛血清白蛋白封閉，37℃，2 h，PBST（pH7.4）洗滌 3 次，加入2倍系列稀釋的新西蘭大白兔血清，37℃，1 h，PBST（pH7.4）洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG（1:5000 稀釋）,37℃，1 h，PBST（pH7.4）洗滌3次，加入TMB底物溶液100 μL/孔，37℃ 孵育10 min，加入 2 mol/L 硫酸 50 μL/孔終止顯色，在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用特異性引物，PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)，由圖1可以看出，在約500 bp處的擴(kuò)增條帶，其大小與NS79基因大小基本一致，預(yù)測(cè)目的基因擴(kuò)增成功。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以EcoRⅠ和NotI對(duì)膠回收產(chǎn)物NS79基因和原核質(zhì)粒載體pET-32 a進(jìn)行雙酶切，將酶切的NS79E片段和載體片段，通過T4DNA連接酶16℃過夜連接。轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，PCR鑒定陽性菌并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的基因片段以及質(zhì)粒上的插入位點(diǎn)無誤。轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽性克隆，保存菌體。

2.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)和純化

將含有重組質(zhì)粒的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)其OD600為0.6時(shí)，用IPTG誘導(dǎo)，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)前后的菌體分別沉淀處理后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)鑒定，并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色1-2 h，進(jìn)行脫色處理，取出顯色清晰的凝膠進(jìn)行觀察，如圖2所示，在分子量約為35 kDa處，誘導(dǎo)菌體對(duì)比未誘導(dǎo)菌體有一明顯加粗的蛋白條帶，即為誘導(dǎo)成功的NS79重組蛋白。將表達(dá)的重組蛋白用Ni-IDA柱純化和透析除去尿素后，得到純化的NS79重組蛋白，如圖3所示。

圖2 重組NS79誘導(dǎo)檢測(cè)M：蛋白 marker；1：IPTG 誘導(dǎo)；2：IPTG 未誘導(dǎo)Fig 2.Induction of recombinant NS79M:protein marker;1,IPTG induction;2,No IPTG induction

圖3 NS79重組蛋白純化M：蛋白 marker；1-2：純化的 NS79 重組蛋白Fig 3.Purification of recombinant protein NS79M:protein marker;1-2:purified NS79 recombinant protein

2.4 抗體的制備和抗體效價(jià)的檢測(cè)

純化后的重組蛋白免疫新西蘭大白兔，四周后耳緣靜脈取血，靜置后取上清，獲得血清抗體，將純化后的重組蛋白作為抗原包被到96孔板上，以2倍梯度稀釋(起始稀釋比1∶500)的抗體作為一抗，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，若實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照吸光值相比，比值大于等于2視為陽性，如圖4所示，從圖中看出測(cè)其抗體效價(jià)為1：64000時(shí)仍為陽性，因此抗體制備成功，可用于NS79功能的進(jìn)一步研究。

圖4 抗體效價(jià)檢測(cè)圖橫坐標(biāo)為抗體的稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)為吸光值，每組數(shù)據(jù)三個(gè)重復(fù)，柱上線為誤差線，誤差線上數(shù)值為實(shí)驗(yàn)組的平均值與陰性對(duì)照平均值的比值Fig 4.Detection of antibody titer.The abscissa is the dilution of the antibody,the ordinate is the absorbance value,and each group has three replicates.The on-line is the error line.The numbers above error line is the ratio of the experimental group average with the negative control average.

3 討論

草魚出血病作為一種嚴(yán)重危害草魚健康傳染性疾病，流行范圍廣，致病性高，影響著我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)的正常發(fā)展，其病原體草魚呼腸孤病毒是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus，AQRV)中毒力最強(qiáng)的一種。雖然我國(guó)對(duì)草魚呼腸孤病毒這一課題的研究比較早，但分子生物學(xué)、病原學(xué)、免疫學(xué)等層面的研究仍舊有待進(jìn)一步的深入研究。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)草魚呼腸孤病毒NS79基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，得到了正確的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒表達(dá)提取并且純化蛋白，將純化的蛋白免疫新西蘭大白兔，制備了NS79原核表達(dá)的多克隆抗體，用ELISA的方法檢測(cè)的抗體的效價(jià)大于1:64000。就目前而言，尚沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道NS79蛋白在病毒感染中的作用，因而其實(shí)際功能仍不清楚，但是我們可以根據(jù)其同源蛋白預(yù)測(cè)其功能。Ⅰ型草魚呼腸孤病毒中，非結(jié)構(gòu)蛋白NS80蛋白形成病毒包涵體的基本結(jié)構(gòu)，病毒包涵體是病毒組裝和復(fù)制的場(chǎng)所[12]，并且招募病毒的其他蛋白到包涵體中，將病毒的各結(jié)構(gòu)成分組裝成完整的病毒粒子[13]。在Ⅱ型草魚呼腸孤病毒中，與NS80同源的蛋白為NS79蛋白，因而預(yù)測(cè)NS79蛋白也具有形成病毒包涵體的功能。Ⅱ型草魚呼腸孤病毒作為目前國(guó)內(nèi)分布最廣、流行最為嚴(yán)重、致病力最強(qiáng)的草魚呼腸孤病毒，NS79蛋白很可能與其所特有的一些生物學(xué)特性密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于II型呼腸孤病毒研究提供了前提基礎(chǔ)，可用于NS79在病毒致病機(jī)制方面的研究。

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