陸陳晨 譚樹華

摘 要： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是藥用蛋白的主要表達(dá)方式，傳統(tǒng)的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)有諸多不利，本文介紹常用的貼壁細(xì)胞懸浮馴化的方法，通過(guò)將貼壁細(xì)胞馴化成懸浮細(xì)胞，提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)水平，降低生產(chǎn)成本。

關(guān)鍵詞： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞；馴化；無(wú)血清培養(yǎng)

重組蛋白表達(dá)是研究蛋白質(zhì)功能與結(jié)構(gòu)、藥物篩選以及后續(xù)應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常規(guī)的蛋白表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)和真核表達(dá)兩大類?，F(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)的快速發(fā)展需要重組蛋白擁有接近天然蛋白分子的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物功能，特別是糖蛋白及抗體類藥物。這就要求表達(dá)的重組蛋白需要正確的翻譯后修飾、組裝和折疊，這是原核表達(dá)系統(tǒng)所欠缺的[1-2]。真核表達(dá)系統(tǒng)包括酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其中以哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)較為常用。

1 貼壁細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的缺點(diǎn)

傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)或表達(dá)外源重組蛋白采用貼壁細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，這種表達(dá)方式雖然操作簡(jiǎn)便，但細(xì)胞密度和表達(dá)量較低，并且培養(yǎng)時(shí)需要加入血清，亦具很多缺點(diǎn)[3]：

1.1 血清組分復(fù)雜，含有多種雜蛋白不利于目的蛋白純化；

1.2 血清批間差異較大，不同批次的血清濃度不穩(wěn)定，影響工藝的連貫性；

1.3 血清中可能攜帶有未充分滅活的動(dòng)物病毒或支原體，有細(xì)胞污染和傳染人類的風(fēng)險(xiǎn)。

2 細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)

細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)由于具有培養(yǎng)基的化學(xué)成分限定、批間產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、簡(jiǎn)化下游生產(chǎn)、生理環(huán)境易于控制等優(yōu)點(diǎn)，在重組蛋白表達(dá)、單克隆抗體制備和疫苗生產(chǎn)等中應(yīng)用廣泛。

3 貼壁細(xì)胞馴化成懸浮細(xì)胞的方法

3.1 分子生物學(xué)手段改造

貼壁細(xì)胞馴化成懸浮細(xì)胞通常有兩種方法，一種是通過(guò)分子生物學(xué)手段，改造貼壁細(xì)胞。Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono 等人通過(guò)將編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子 I（IGF-I）和轉(zhuǎn)鐵蛋白的基因穩(wěn)定整合到CHO-K1細(xì)胞系的基因組中，使用 lac 操縱子/阻遏子系統(tǒng)調(diào)控 IGF-I 基因的表達(dá)。這種被稱為Super CHOr的細(xì)胞系接種到微載體或以懸浮方式培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)異丙基-D 硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)，可以在無(wú)外源蛋白添加的培養(yǎng)基中以 20-24 小時(shí)倍增速度自分泌生長(zhǎng)，改造后的懸浮細(xì)胞適用于生產(chǎn)重組蛋白。

3.2 降低培養(yǎng)基血清含量

另一種常用的貼壁細(xì)胞馴化方法是逐步降低培養(yǎng)基血清含量，細(xì)胞適應(yīng)后最后換成無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)[4]。楊棟，牛紅軍等人采用逐步降低血清法將表達(dá) rHuEPO 的貼壁 CHO-EPO 工程細(xì)胞株馴化成懸浮細(xì)胞，搖瓶培養(yǎng)，最終接種至生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)，具體通過(guò)每 2 天棄去貼壁培養(yǎng)的 CHO-EPO 方瓶中一半舊培養(yǎng)基，加入等量的無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 B001，培養(yǎng)基中血清濃度依次以5%，2.5%，1.25%，0.625% 降低。當(dāng)血清濃度降至 1% 以下，完全以基礎(chǔ)培養(yǎng)基 B001 繼續(xù)培養(yǎng)，即得懸浮 CHO-EPO 細(xì)胞[5]。

4 展望

無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比貼壁細(xì)胞既可提高細(xì)胞的培養(yǎng)密度，黃錠，趙亮，譚文松等人在犬腎細(xì)胞MDCK馴化時(shí)研究發(fā)現(xiàn)MDCK細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞延滯期縮短，細(xì)胞生長(zhǎng)速度增快，活細(xì)胞密度和細(xì)胞活力提高，葡萄糖比消耗速率、乳酸和氨的比生成速率都大幅降低，而乳酸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率有所升高[6]。同時(shí)也消除了血清中動(dòng)物源性成分對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響，由于雜蛋白較少，也便于后續(xù)純化，更有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。另外，不同的重組蛋白工程細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)可能適用于不同類型的無(wú)血清培養(yǎng)基，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基優(yōu)化篩選可使懸浮細(xì)胞在最優(yōu)的條件下生長(zhǎng)和表達(dá)重組蛋白。

參考文獻(xiàn)

[1] Jayapal KP， Wlaschin KF， Hu WS ， Yap HGS .Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting， Chem Eng Prog[J]，103：2007（40-47）.

[2] Wurm FM .Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells， Nat Biotechnol[J]， 22：2004（1393 -1398）.

[3] S.C.O. Pak， S.M.N. Hunt， M.W. Bridges， M.J. Sleigh & EE Gray，Super-CHO-A cell line capable of autocrine growth under fully defined protein-free conditions， Cytotechnology[J]， 1996， 22：（139-146）.

[4] Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono， Sybille Hunt， Charles Bailey， Masood Baig， Merilyn Sleigh & Peter Gray Regulated autocrine growth of CHO cells， Cytotechnology[J]， 2000， 34：（39–46）.

[5] YANG Dong， NIU Hong-jun， LU Gang， SHI Jia-lin， SUN Hao-ming， LI Hui* An Optimized Method for Suspension Culture of CHO Cells to Produce Recombinant Human Erythropoietin （EPO）， Progress in Modern Biomedicine[J]， （2012）， 26-5053-04.

[6] Ding Huang， Liang Zhao， and Wensong Tan Adherent and single-cell suspension culture of Madin-Darby canine kidney cells in serum-free medium， Chinese Journal of Biotechnology[J]， 2011， 27（4）： 645？652.