公丕學(xué)，楊昊，廉貞霞，薛霞，劉桂亮，王駿，劉艷明*

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，濟(jì)南 250101；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南 250101)

愛德萬甜(Advantame)，分子式為N-(N-(3-(3-羥基-4-甲氧基苯基)丙基-L-a-天冬氨酰)-L-苯丙氨酸-1-甲酯)(C24H30N2O7·H2O)，分子量為476.52，是阿斯巴甜的衍生產(chǎn)品，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與紐甜類似，見圖1，是一種非營養(yǎng)、低熱量、高強(qiáng)度的新型甜味劑，用量可以遠(yuǎn)低于現(xiàn)有市場上的蔗糖和其他甜味劑，能添加于多種食品中，甜味可達(dá)蔗糖的20000倍。2014年5月21日，美國FDA發(fā)布最終法規(guī)，修訂食品添加劑條例，批準(zhǔn)高倍甜味劑Advantame作為非營養(yǎng)甜味劑和增味劑用于除肉類及家禽之外的食品中[1]。日本厚生勞動省、FSANZ、美國FDA等允許愛德萬甜作為甜味劑使用，根據(jù)FAO/WMO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)的評估結(jié)果，愛德萬甜每日最大允許攝入量不超過5 mg/kg·bw[2,3]。

圖1 愛德萬甜分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structure of advantame

目前，在國外愛德萬甜作為一種新型超級甜味劑被廣泛應(yīng)用于食品、飲料和藥品中,其安全性得到了國外食品安全機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。國家衛(wèi)計委在2017年10月31日發(fā)布《關(guān)于愛德萬甜等6種食品添加劑新品種、環(huán)己基氨基磺酸鈉(又名甜蜜素)等6種食品添加劑擴(kuò)大用量和使用范圍的公告(2017年第8號)》[4]，該物質(zhì)可作為甜味劑用于多種食品類別，改善食品口感。國內(nèi)僅有檢測飲料中愛德萬甜的液相色譜方法報道[5]，分離時間為15 min，線性范圍為0.05～5.0 mg/L。在測定復(fù)雜基質(zhì)時，液相色譜法存在干擾，降低方法的靈敏度，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。國內(nèi)還沒有愛德萬甜的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測方法，超高效液相色譜(UPLC)比高效液相色譜(HPLC)分析速度更快，分離能力更好，LC-MS/MS法將LC對復(fù)雜基質(zhì)樣品的分離優(yōu)勢，與串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品分析檢測[6-9]。液體乳基質(zhì)復(fù)雜，在檢測中能夠顯著影響目標(biāo)離子生成效率及離子強(qiáng)度，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度。因此前處理過程中應(yīng)除去干擾成分，常用的前處理方式有直接提取[10,11]、液液萃取[12]、SPE[13]、沉淀蛋白[14]、QuECHERS等方法[15-18]。

本研究結(jié)合SPE技術(shù)，采用UPLC串聯(lián)MS技術(shù)檢測液體乳中的愛德萬甜，10 min 內(nèi)即可完成目標(biāo)物的分析檢測，線性范圍寬，檢出限低，對食品中愛德萬甜的檢測有更廣闊的應(yīng)用前景。去除食品中基質(zhì)干擾，提高分析靈敏度，建立了檢測液體乳中愛德萬甜的UPLC電噴霧串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法，填補(bǔ)了國內(nèi)檢測愛德萬甜質(zhì)譜定性定量法的空白，對國內(nèi)愛德萬甜的探索研究具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熱電TSQ Quantiva三重四級桿質(zhì)譜儀配備ESI電離源，熱電U-3000液相色譜儀 美國賽默飛世爾公司；BSA822-cw型電子天平 德國賽多利斯公司；AB204-S型電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；MS-3基本型旋渦混合器 德國艾卡公司；超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；高速冷凍離心機(jī) 德國西格瑪公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國密理博公司；控溫氮吹儀 美國Organomation公司；HLB SPE柱(3 mL/60 mg) 美國Waters公司。

色譜柱：Accucore C18(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，色譜純乙腈，色譜純甲醇：購于美國Thermo Fisher公司；色譜純醋酸銨：購于德國Flukar公司；分析純氨水，分析純亞鐵氰化鉀，分析純乙酸鋅：購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑(北京)有限公司；愛德萬甜標(biāo)樣(純度≥97.0%)：購于美國Sigma-Aldrich公司；0.22 μm孔徑有機(jī)濾膜：購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制: 準(zhǔn)確稱取愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)品 10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，配成1.00 mg/mL 的儲備液，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 樣品預(yù)處理

1.2.1 樣品提取

稱取2 g(精確到0.01 g)液體乳樣品到50 mL離心管中，加10 mL水渦旋分散混勻，分別準(zhǔn)確加入沉淀劑0.3 mL亞鐵氰化鉀溶液(質(zhì)量濃度為106 g/L)、0.3 mL乙酸鋅溶液(質(zhì)量濃度為183 g/L)渦旋分散混合均勻，超聲波清洗器中超聲提取30 min后，用水定容至15 mL，在離心機(jī)中以8000 r/min高轉(zhuǎn)速下離心5 min，過濾取清液待凈化。

1.2.2 樣品凈化

用3 mL甲醇、3 mL水活化HLB SPE 柱，將提取清液以1滴/s的速度上樣，5 mL 5%甲醇淋洗，抽干，用5 mL甲醇分2次洗脫，然后用甲醇直接定容至5 mL，定溶液經(jīng)有機(jī)濾膜過濾后待上機(jī)檢測。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件色譜柱

Accucore C18；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%甲酸，液相色譜流動相梯度洗脫程序見表1；流動相流速：0.30 mL/min；柱溫箱溫度：40 ℃；進(jìn)樣針進(jìn)樣體積：5 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution program

1.3.2 質(zhì)譜條件電離源離子化模式

電流方式ESI+；氣體流速： 40 units；輔助氣體流速：12 units；噴霧電壓：3500 V；離子傳輸管溫度：333 ℃；蒸發(fā)器溫度：317 ℃；碰撞氣體壓力(Ar)：2mTorr。愛德萬甜優(yōu)化的關(guān)鍵質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 愛德萬甜優(yōu)化的關(guān)鍵質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The optimized MS parameters of advantame

注：*為定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

流動相的酸堿性影響愛德萬甜離子化效率，同時會影響液相色譜峰峰形，本試驗比較了中性流動相A(乙腈-水)、堿性流動相B(乙腈-0.1%氨水，V/V)、酸性流動相C(乙腈-0.1%甲酸，V/V)3種不同酸度流動相體系。在相同液相色譜分離程序下，考察愛德萬甜色譜峰峰形以及響應(yīng)情況，定量離子質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 愛德萬甜在不同酸度流動相的定量離子(459>192)質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrograms(459>192) of advantame in different mobile phases

注：A為中性流動相；B為堿性流動相；C為酸性流動相。

實驗結(jié)果表明：乙腈-0.1%甲酸流動相條件下的目標(biāo)物峰形要優(yōu)于另外兩種流動相的峰形，質(zhì)譜信號響應(yīng)值增強(qiáng)。實驗中采用正離子模式檢測，使用酸性流動相能夠提高愛德萬甜離子化效率，響應(yīng)信號強(qiáng)度增強(qiáng)，靈敏度提高。使用堿性流動相抑制愛德萬甜離子化效率，信號強(qiáng)度降低了1/2，中性流動相中信號強(qiáng)度降低，峰形差，影響定性定量結(jié)果。因此，選取乙腈-0.1%甲酸作為流動相，色譜峰峰形好，靈敏度高。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜中常用的電離方式有ESI和APCI，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)可以看出愛德萬甜屬于極性較強(qiáng)的化合物，APCI優(yōu)勢在于檢測中等或者小極性的化合物，因此試驗中選擇ESI電離分析方式。

愛德萬甜分子結(jié)構(gòu)中含有2個仲氨基團(tuán)，容易結(jié)合氫，形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，因此在質(zhì)譜檢測中離子源電離模式選擇時，應(yīng)該首先考慮使用ESI+模式。愛德萬甜分子量為476.52，去掉H2O后的分子量為458.504，根據(jù)形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰推算出母離子為459.504 m/z。將質(zhì)量濃度為100 ng/mL的愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)溶液通過蠕動泵直接注入三重四級桿質(zhì)譜儀，在ESI+模式下進(jìn)行愛德萬甜母離子掃描，確定其準(zhǔn)分子離子峰豐度最大條件，得到愛德萬甜的母離子為459 m/z；調(diào)節(jié)質(zhì)譜關(guān)鍵參數(shù)后進(jìn)行愛德萬甜的子離子掃描，然后進(jìn)一步優(yōu)化碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)，選擇2個豐度較高的子離子，以豐度相對高的子離子459>192作為定量離子，以豐度相對較低的子離子459>102作為輔助定性離子。愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM見圖3。

圖3 愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of advantame standard solution

注：A為定量離子459>192；B為定性離子459>102。

2.3 沉淀劑使用量的影響

液體乳中含有蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂等，在分析檢測過程中，基質(zhì)成分與待測物在霧滴表面離子化競爭過程中能夠顯著增強(qiáng)或降低目標(biāo)離子生成效率及離子強(qiáng)度，從而對檢測結(jié)果會產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此在前處理過程中需加入沉淀劑去除雜質(zhì)組分的干擾。沉淀劑的使用量影響沉淀效果和過濾時間,因此考察了沉淀劑的加入體積為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL時與過濾時間的對應(yīng)關(guān)系，見圖4中A。不加入沉淀劑時，過濾時間較長，當(dāng)沉淀劑用量大于0.3 mL時，過濾時間小于12 min并趨于穩(wěn)定?？疾炝顺恋韯┘尤塍w積為0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0 mL對峰面積響應(yīng)值的影響，見圖4中B。

圖4 沉淀劑使用量的影響Fig.4 The influence of precipitant

注：A為沉淀劑使用量與過濾時間的關(guān)系；B為沉淀劑使用量與峰面積的關(guān)系。

當(dāng)沉淀劑大于0.3 mL時峰面積響應(yīng)值逐漸降低，靈敏度降低，綜合考慮，選擇沉淀劑體積為0.3 mL時，既可以提高工作效率，又可以保證檢測靈敏度。

2.4 SPE柱的選擇

SPE柱的使用能夠進(jìn)一步提高雜質(zhì)去除效果和靈敏度。在實驗中考察了C18柱、WAX柱、HLB柱、 SAX柱和 MAX柱5種SPE柱對液體乳中愛德萬甜的凈化效果，見圖5。

圖5 愛德萬甜通過不同SPE柱的回收率Fig.5 The recoveries of advantame through different SPE columns

由圖5可知，使用HLB SPE柱時回收率最高，因此實驗中選用HLB SPE柱凈化樣品，提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度。

2.5 方法的線性范圍和檢出限

將基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按濃度從低到高依次經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，以愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，以其豐度較高的定量離子對響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在1～1000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=8001x-9.554，線性相關(guān)系數(shù)為0.9992。以信號與噪音比值S/N≥3作為檢出限(LOD)計算結(jié)果為2 μg/kg?？瞻讟悠飞V圖見圖6，樣品加標(biāo)色譜圖見圖7。

圖6 空白樣品質(zhì)量色譜圖Fig.6 MRM chromatograms of blank samples

注：A為定量離子459>192；B為定性離子459>102。

圖7 加標(biāo)樣品質(zhì)量色譜圖Fig.7 MRM chromatograms of spiked samples

注：A為定量離子459>192；B為定性離子459>102。

2.6 方法的回收率和精密度

采用不同類型液體乳(滅菌乳、調(diào)制乳和發(fā)酵乳)空白樣品，進(jìn)行添加回收率和精密度的實驗?？瞻讟悠分蟹謩e添加50，100，500 μg/kg 3個濃度水平，按照本方法進(jìn)行處理，每個添加水平進(jìn)行平行測定6次。同時使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率和偏差計算，結(jié)果見表3。

表3 添加回收率與精密度(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs for the determination of advantame(n=6)

由表3可知，愛德萬甜的回收率在90%～116%。不同水平加標(biāo)樣品重復(fù)測定6次，測定結(jié)果表明RSD為0.21%～1.59%。結(jié)果表明該方法能夠滿足實際樣品的檢測需要。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化實驗條件，選擇沉淀劑(亞鐵氰化鉀和乙酸鋅)分別為0.3 mL，HLB SPE柱，能夠提高方法的準(zhǔn)確性及靈敏度，選擇能夠增強(qiáng)離子化效率的酸性流動相(乙腈-0.1%甲酸)，建立了SPE-超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測液體乳中愛德萬甜的分析方法。

本方法具有線性范圍寬、檢出限低、效率高、靈敏度高、定性、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于不同類型液體乳中愛德萬甜的定性確證與定量檢測，填補(bǔ)了國內(nèi)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定愛德萬甜的空白，可以為政府監(jiān)管提供技術(shù)支持，為制定食品安全標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

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