丁素君，何新蕾

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)教研室，河南 漯河 462002)

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA) 為天然氨基酸，為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、鎮(zhèn)靜和改善腦、肝、腎等生理功能。而GABA可通過微生物提供的谷氨酸脫羧酶對(duì)谷氨酸進(jìn)行脫羧產(chǎn)生[1]。而傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉含有豐富的谷氨酸，通過微生物發(fā)酵可獲得足夠量的 GABA，但由于工藝不同，差異也挺大，因此了解不同豆豉中的GABA含量是必要的[2]。目前，GABA的測(cè)定方法較多，包括比色法、電泳法、氣相色譜法以及液相色譜法，其中由于GABA對(duì)電化學(xué)和紫外-可見光靈敏度低，HPLC需要進(jìn)行柱前衍生[3]。而柱前衍生劑有異硫氰酸苯酯(PITC)、鄰苯二甲醛(OPA)-巰基乙醇、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)等，其中OPA衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，且自身帶有一定的刺激性氣味，AQC水解后產(chǎn)物易產(chǎn)生干擾峰[4]。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)分析采用磺酰氯二甲胺偶氮苯(DABS-Cl)作為柱前衍生劑，采用HPLC快速、準(zhǔn)確測(cè)定豆豉中γ-氨基丁酸水平。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) Waters公司；TGL-16C 臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Sartorius Bp211D 電子天平 德國(guó)Sartorius。

1.2 試劑與材料

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品：購自美國(guó)Sigma公司；磺酰氯二甲胺偶氮苯：購自Supecol公司；甲醇、乙腈均為HPLC級(jí)；水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

重慶永川豆豉冷凍干燥、粉碎，過40目，精確稱取 0.5 g 凍干粉，加入20.0 mL 10%的三氯乙酸，渦旋2 min，45 ℃水浴中超聲輔助提取2 h，3000 r/min離心10 min，取上清， 0.45 μm纖維素膜過濾，備用。

1.3.2 衍生條件

精密量取樣品液100 μL，冷凍干燥，0.1 mol/L碳酸鹽體系(pH為9.0)復(fù)溶，4 mmol/L 的DABS-Cl衍生劑溶液(DABS-Cl 129.5 mg、乙腈10 mL)100 μL，混勻，70 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min，加300 μL終止液(150 μL 40 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH為6.5，150 μL無水乙醇)，混勻，3000 r/min 離心10 min，取上清,0.45 μm濾膜過濾，20 μL進(jìn)樣。

1.3.3 色譜條件

695型液相色譜儀帶二極管陣列檢測(cè)器；默克RP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：(乙腈∶甲醇為75∶25)流動(dòng)相B：(0.04 mmol/L 醋酸鈉，pH為7.3) ；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：430 nm；洗脫條件：0～10 min，75%A；10～25 min，60%A；25～26 min，45%A；26～30 min，25%A。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

圖1 γ-氨基丁酸波長(zhǎng)掃描圖

由圖1可知，γ-氨基丁酸衍生后在300～450 nm的吸收光譜，其中430 nm處吸收峰較高，故選擇430 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 分離效果

本色譜條件能將γ-氨基丁酸與其他氨基酸做到基線分離，干擾小，見圖2。

圖2 γ-氨基丁酸色譜圖

2.3 衍生條件的優(yōu)化

考察了不同的pH、溫度和衍生時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸測(cè)定的影響。結(jié)果顯示：pH為9.0，70 ℃反應(yīng)20 min后，峰面積最大，見表1～表3。

表1 pH對(duì)γ-氨基丁酸衍生的影響

表2 溫度對(duì)γ-氨基丁酸衍生的影響

表3 衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸衍生的影響

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和重復(fù)性

0.1 mol/L pH 9.0碳酸鹽體系配制濃度分別為24.00，12.00，6.00，3.00，1.50 μg/mL的GABA對(duì)照品溶液和4 mmol/L的DABS-Cl衍生劑溶液，于70 ℃反應(yīng)20 min，加入300 μL衍生反應(yīng)終止液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以γ-氨基丁酸為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得γ-氨基丁酸線性方程為：Y=2.48063X×105+1.52957×105(r=0.9997)，可見γ-氨基丁酸在(1.50～24.00 μg/mL)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密吸取樣品溶液6份，每份100 μL，參照1.3.2制備衍生溶液，進(jìn)樣，記錄峰面積，測(cè)定γ-氨基丁酸的含量，結(jié)果顯示：γ-氨基丁酸的平均含量為16.22 μg/mL，RSD值為3.17%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取衍生后同期重慶永川豆豉樣品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果γ-氨基丁酸峰面積RSD值為1.51%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取衍生后同期重慶永川豆豉樣品溶液20 μL分別在0，4，8，12，24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果峰面積的RSD值為1.12%，表明衍生后樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同期重慶永川豆豉樣品0.25 g凍干粉，平行試驗(yàn)9份，分別加入γ-氨基丁酸適量，按1.3.1和 1.3.2制備樣品后，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，并計(jì)算加樣回收率，見表4。γ-氨基丁酸平均加樣回收率為100.83%，RSD值為2.25%，結(jié)果表明加樣回收率試驗(yàn)良好。

表4 γ-氨基丁酸加樣回收率試驗(yàn)

續(xù) 表

2.8 實(shí)際樣品的檢測(cè)

對(duì)市售5類豆豉中的 GABA 含量進(jìn)行了測(cè)定，陜西商洛豆豉255.4 mg/kg，四川黃豆豆豉147.5 mg/kg，廣東陽江豆豉551.4 mg/kg，重慶永川豆豉648.9 mg/kg，湖北豆豉1461.0 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究建立了DABS-Cl柱前衍生-HPLC測(cè)定豆豉中γ-氨基丁酸的方法，該方法檢測(cè)結(jié)果不會(huì)受到氨基酸DABS-Cl衍生物的影響，并且能做到γ-氨基丁酸與其他氨基酸基線分離，干擾小，適用性更強(qiáng)，準(zhǔn)確、可靠，可用于對(duì)該類豆制品物質(zhì)的測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

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