尚云濤，陳奕霖，曹佳蕊，任春雪，范寶莉，劉曉穎，王振英*

(1.天津師范大學(xué) 天津市水資源與水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2.天津師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，天津 300387；3.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387;4.天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387)

大蒜(AlliumsativumL.)屬于百合科蔥屬植物，是我國人民餐桌上廣受歡迎的香辛類蔬菜，具有重要的食用和藥用價(jià)值。最新研究證實(shí)大蒜中含有多種生物活性物質(zhì)如大蒜素、多糖等具有較顯著的抗病毒、抑制癌細(xì)胞活性及抗血栓、降血脂、降血壓和緩解動(dòng)脈粥樣硬化等功效[1]。

蔬菜中含有的常規(guī)無機(jī)陰離子主要有氟、氯、溴、亞硝酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等，其中氟是人體必需的微量元素，但過量的氟有可能影響植物生長(zhǎng)，并可以通過生物富集作用對(duì)人體的健康產(chǎn)生危害。植物體內(nèi)的無機(jī)氟化物還可能轉(zhuǎn)變?yōu)榉宜岬任：Ω蟮挠袡C(jī)氟化物[2]。氯是在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用的微量元素，在參與植物光合作用、調(diào)節(jié)氣孔、維持細(xì)胞滲透壓及抗病蟲害等方面起著重要作用[3]。通過測(cè)定植物氯離子含量可以評(píng)價(jià)植物的生理狀態(tài)。硝酸鹽可以通過微生物的作用轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽可以生成致癌物亞硝胺危害人體健康[4]。蔬菜是人體攝入硝酸鹽的重要來源。溴酸鹽是一種潛在致癌物，在飲用水研究中已有相關(guān)報(bào)道顯示用臭氧消毒含有溴離子的水時(shí)可以產(chǎn)生溴酸鹽，且溴酸鹽含量與水中溴離子濃度呈正相關(guān)關(guān)系[5,6]。臭氧消毒技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蔬菜的冷藏保鮮，對(duì)于大蒜中溴離子含量的測(cè)定有利于全面評(píng)估大蒜保鮮工藝中的潛在食品安全風(fēng)險(xiǎn)。磷酸鹽及硫酸鹽含量的準(zhǔn)確分析，可以更加全面地評(píng)價(jià)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及環(huán)境因素對(duì)作物的影響。因此，大蒜中上述7種無機(jī)離子的定量分析將對(duì)完善大蒜質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及保障食品安全具有重要意義。

目前定量分析氟離子的方法主要有電極法和離子色譜法[7-9]，氯離子分析方法主要有滴定法[10]、光譜法[11]和離子色譜法，溴離子分析方法主要有熒光法和離子色譜法[12,13]，硝酸鹽和亞硝酸鹽分析方法主要有比色法和離子色譜法，磷酸鹽和硫酸鹽分析方法主要有離子色譜法[14-16]。其中滴定法、光譜法、比色法等普遍存在定量誤差大、分析效率低、操作繁瑣等問題。離子色譜法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、線性范圍廣、分析效率高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于蔬菜中無機(jī)陰離子的檢測(cè)。而采用離子色譜分析技術(shù)同時(shí)檢測(cè)大蒜中上述7種陰離子的研究鮮有報(bào)道。

大蒜鱗莖中富含蛋白質(zhì)、多糖、脂類、有機(jī)酸、含硫化合物等多種有機(jī)物[17]，進(jìn)行分析前必須經(jīng)過凈化以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性以及延長(zhǎng)分析柱、抑制器的使用壽命。固相萃取技術(shù)以其操作便捷、處理效率高、種類多、商品化程度高、一次性使用避免樣品交叉污染、可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化及在線處理等優(yōu)勢(shì)已被廣泛應(yīng)用于離子色譜分析中的前處理技術(shù)[18]。

本研究擬建立一種高效準(zhǔn)確的離子色譜法，以固相萃取作為前處理技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)大蒜鱗莖中上述7種無機(jī)陰離子，為大蒜品質(zhì)的全面評(píng)估和食品安全管理提供了一種新的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國Dionex公司ICS-600型離子色譜儀(配有電導(dǎo)檢測(cè)器、抑制器、ASDV自動(dòng)進(jìn)樣器、Chromeleon 6工作站)；美國Supelco固相萃取儀；密理博超純水機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

市售大蒜蒜頭：外形飽滿，無霉變、蟲蛀。

1.3 試劑耗材

氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鈉、亞硝酸鈉、氟化鈉、溴化鈉、磷酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉：均為基準(zhǔn)試劑；C18固相萃取小柱(500 mg，3 mL，美國Supelco)；超純水機(jī)：電阻率≥18.2 MΩ·cm。

1.4 色譜分析體系

分析柱：Dionex Ion Pac AS14；保護(hù)柱：Dionex Ion Pac AG14；抑制器：AERS 500,4 mm自動(dòng)再生抑制器；流速：1.2 mL/min；抑制器電流：50 mA；定量環(huán)：10 μL；淋洗液：3.5 mol/L Na2CO3和1.0 mol/L NaHCO3。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確配制F-，Cl-， NO3-，NO2-，Br-，SO42-，PO43-混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度分別為200，1500，1000，1000，500，1500，1000 mg/L，再梯度稀釋配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6 樣品前處理

稱取大蒜鱗莖20 g加25～30 mL蒸餾水破碎、研磨，靜置提取30 min，蒸餾水定容至50 mL，5000×g離心15 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，作為樣品提取液；C18固相萃取小柱經(jīng)5 mL甲醇、10 mL超純水活化，平衡15 min；將樣品提取液以4 mL/min速度過柱，棄去最先流出的2～3 mL溶液，收集余下的洗脫液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，適當(dāng)稀釋后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子色譜分析體系

通過對(duì)淋洗液濃度配比、流速、抑制器電流等分離條件的優(yōu)化，最終確定淋洗液濃度為3.5 mol/L Na2CO3和1.0 mol/L NaHCO3，流速為1.2 mL/min，抑制器電流為50 mA為最適色譜分析體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：7種陰離子分離度及對(duì)稱性良好，可以在12 min內(nèi)完成高效分離(見圖1和圖2)。

圖1 7種陰離子混合標(biāo)樣離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of seven inorganic anions mixed standard solution

注：1為F-,2為Cl-,3為NO2-,4為Br-,5為NO3-,6為PO43-,7為SO42-。

圖2 大蒜鱗莖樣品離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of garlic bulb sample

注：1為F-，2為Cl-，3為NO2-，4為Br-，5為NO3-，6為PO43-，7為SO42-。

2.2 淋洗液濃度及流速的選擇

為使大蒜鱗莖中各組分無機(jī)陰離子達(dá)到良好的分離效果并兼顧分離效率，考察了不同淋洗液濃度及流速對(duì)待測(cè)組分的影響。結(jié)果表明：隨淋洗液濃度的升高，各組分保留時(shí)間縮短；色譜峰不對(duì)稱度增大，峰形受到影響；分離度降低，分離效果變差；采用3.50 mol/L Na2CO3和1.00 mol/L NaHCO3的淋洗液時(shí)各組分不對(duì)稱度在1.12～1.43，分離度均大于2.0，分離效果較好(見表1)。淋洗液流速同樣會(huì)對(duì)影響待測(cè)組分峰屬性產(chǎn)生影響，結(jié)果表明隨流速的增大，各組分保留時(shí)間縮短；不對(duì)稱度先降低、峰形改善，后又升高、峰形變差；分離度降低，分離效果變差；系統(tǒng)壓力升高，過高的柱壓不利于泵及抑制器的使用，流速在1.0～1.2 mL/min范圍內(nèi)較好(見表2)。綜合考慮上述影響因素，本研究選擇3.50 mol/L Na2CO3和1.00 mol/L NaHCO3的淋洗液濃度及1.2 mL/min流速進(jìn)行研究。

表1 淋洗液濃度對(duì)無機(jī)陰離子峰屬性的影響Table 1 Effect of eluent concentration on peak properties of inorganic anions

注：1為1.72 mol/L Na2CO3和0.50 mol/L NaHCO3；2為3.00 mol/L Na2CO3和0.85 mol/L NaHCO3；3為3.50 mol/L Na2CO3和1.00 mol/L NaHCO3；4為4.50 mol/L Na2CO3和1.30 mol/L NaHCO3。

表2 流速對(duì)無機(jī)陰離子峰屬性的影響Table 2 Effect of flow rate on peak properties of inorganic anions

注：“*”表示流速單位為mL/min。

2.3 線性范圍及檢出限

7種陰離子以峰面積對(duì)濃度(mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，見表3。結(jié)果表明：7種陰離子線性范圍良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表3 7種陰離子標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges, LODs of seven inorganic anions standard curves

2.4 精密度、重復(fù)性及回收率

取某一產(chǎn)地大蒜鱗莖樣品按1.6方法進(jìn)行前處理，按1.4色譜分析體系上機(jī)進(jìn)行5次平行測(cè)試，計(jì)算保留時(shí)間及峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明：該方法精密度良好，7種陰離子組分保留時(shí)間RSD<1% (n=5)，峰面積RSD<2%(n=5)。

取某一產(chǎn)地大蒜鱗莖樣品5份按1.6方法進(jìn)行前處理，按1.4色譜分析體系上機(jī)測(cè)試，計(jì)算保留時(shí)間及峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明：該方法重復(fù)性良好，7種陰離子組分保留時(shí)間RSD<2%(n=5)，峰面積RSD<3%(n=5)。

取某一產(chǎn)地大蒜鱗莖樣品3份按1.6方法進(jìn)行前處理，添加不同量的7種陰離子標(biāo)樣，按1.4色譜分析體系上機(jī)測(cè)試，計(jì)算回收率。結(jié)果表明：7種陰離子回收率為92%～104%，加標(biāo)回收率較理想，見表4。

表4 樣品加標(biāo)回收率Table 4 Recoveries of target anions spiked in sample

注：“-”表示未檢出。

2.5 樣品含量測(cè)定

對(duì)市售不同產(chǎn)地大蒜鱗莖中7種陰離子組分進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果見表5。

表5 不同產(chǎn)地大蒜樣品測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of garlic samples from different places of origin

注：“-”表示未檢出。

結(jié)果顯示：大蒜鱗莖中共檢測(cè)到F-，Cl-，NO3-，Br-，SO42-，PO43-共6種陰離子，且不同產(chǎn)地大蒜6種陰離子含量差異較大。這可能是由于大蒜品種不同以及原產(chǎn)地土壤性質(zhì)、水肥條件等因素差異引起的。本研究在大蒜鱗莖中未檢測(cè)到NO2-，可能是由于大蒜鱗莖中NO2-含量極低，未達(dá)到檢出限。相比于其他葉菜類、根莖類、瓜類、豆類和茄果類蔬菜[19,20]，大蒜鱗莖中NO3-含量也處于較低水平。蔬菜是人體攝入NO3-的主要途徑，NO3-可能轉(zhuǎn)變?yōu)镹O2-進(jìn)而生成亞硝胺，危害人類健康，因此大蒜是一種較為理想的健康蔬菜。不同產(chǎn)地大蒜鱗莖中Br-含量均較低，提示臭氧消毒技術(shù)對(duì)大蒜造成溴酸鹽污染的可能性較低，但仍有待進(jìn)一步研究。

大蒜鱗莖所含化學(xué)成分復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、脂類、有機(jī)酸以及多種含硫有機(jī)化合物。若不經(jīng)處理直接進(jìn)樣分析，極有可能造成離子色譜保護(hù)柱、分析柱和抑制器的污染，導(dǎo)致柱效下降，影響分離效果，縮短色譜柱及抑制器的使用壽命。本研究選用C18固相萃取小柱對(duì)大蒜鱗莖樣品提取液進(jìn)行前處理，既保證了對(duì)樣品的凈化作用，又保持了對(duì)待測(cè)組分的較高回收率。

3 結(jié)論

采用固相萃取法作為前處理技術(shù)，應(yīng)用Ion Pac AS14陰離子色譜柱、抑制型電導(dǎo)檢測(cè)法同時(shí)檢測(cè)大蒜鱗莖中7種無機(jī)陰離子，12 min內(nèi)完成分析。該方法靈敏度高、分離效果好、操作簡(jiǎn)便、效率高、精密度及重復(fù)性均較為理想，可以適用于大蒜中7種無機(jī)陰離子的定量分析。

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