張麗華

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 250353；2.赤峰工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院教務(wù)處，內(nèi)蒙古 赤峰 024005)

風(fēng)味肽是蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的呈味小分子肽或一定分子量的小肽與還原糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，能顯著改善食品的鮮味、持續(xù)感和醇厚味，是一些醬油及豆醬類調(diào)味品中的主要呈味物質(zhì)[1]。近年來(lái)，肽的呈味功能受到各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]，其較強(qiáng)的呈味特性，也為風(fēng)味料的開(kāi)發(fā)提供了優(yōu)良的底物和前體。

大豆是重要的糧食作物之一，在我國(guó)已有5000多年的種植歷史。大豆中蛋白含量高達(dá)40%，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[3]。且大豆蛋白水解物中氨基酸含量豐富，水解產(chǎn)物質(zhì)量穩(wěn)定，是美拉德風(fēng)味肽開(kāi)發(fā)的理想原料。但是，大豆蛋白在不同蛋白酶作用下，生成的酶解產(chǎn)物在美拉德反應(yīng)中呈味性不同。文章以大豆分離蛋白為原料，通過(guò)不同酶水解，并將水解產(chǎn)物進(jìn)行美拉德反應(yīng)，以水解度和美拉德反應(yīng)后產(chǎn)物的呈味感官評(píng)分為指標(biāo)，篩選2種蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解，并通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)復(fù)合酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳的風(fēng)味大豆肽酶解工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白：山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶：丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶：杰能科(中國(guó))生物工程有限公司；鹽酸、NaOH等化學(xué)試劑：均為分析純。

酸度計(jì) 科?？?上海)電子測(cè)量?jī)x器貿(mào)易有限公司；電子恒溫水浴鍋 上海一科儀器有限公司；電子分析天平 上海京孚儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；CR-21G型高速冷凍離心機(jī) Hitachi日本日立有限公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀 海能(濟(jì)南)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本成分的測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定：依照QB/T 1803-1993進(jìn)行；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：依照GB 5009.5-2010進(jìn)行；水分的測(cè)定：依照GB 5009.3-2010進(jìn)行；灰分的測(cè)定：依照GB 5009.4-2010進(jìn)行；脂肪的測(cè)定：依照GB 5009.6-2016進(jìn)行。

1.2.2 大豆分離蛋白的酶解

稱取20.0 g大豆分離蛋白，加入適量的去離子水，配制成一定濃度的大豆分離蛋白混合液，80 ℃恒溫水浴30 min，降至室溫。加入一定量的蛋白水解酶，調(diào)節(jié)一定的pH、溫度和酶解時(shí)間進(jìn)行酶解，然后于90 ℃滅酶10 min，冷卻后于3000 r/min離心30 min，取上清液冷凍干燥，即為大豆分離蛋白酶解物。

1.2.3 蛋白質(zhì)水解度(DH)的測(cè)定

依據(jù)文獻(xiàn)[4]采用甲醛滴定法進(jìn)行。

1.2.4 美拉德反應(yīng)

取適量的大豆肽，配制成一定濃度的大豆肽溶液，添加一定量木糖混合均勻，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，轉(zhuǎn)移密閉至反應(yīng)器中，在110 ℃下以一定攪拌速度加熱反應(yīng)120 min，反應(yīng)結(jié)束后，冰水迅速冷卻，即為風(fēng)味大豆肽。

1.2.5 感官評(píng)定方法

依照鮮味評(píng)定，參考Ogasawara等的方法[5]。在純凈水中加入1.0%的谷氨酸鈉和0.5%的NaCl，攪拌均勻。加入0.5%的樣品作為品嘗對(duì)象，在60 ℃恒溫水浴10 min，以麥芽糊精代替樣品溶液作為對(duì)照組，進(jìn)行感官評(píng)定。評(píng)定小組由 20位專業(yè)人員組成，打分采用7分制，將麥芽糊精的對(duì)照溶液設(shè)定為3分。評(píng)定內(nèi)容為鮮味、醇厚味、持續(xù)味、焦甜味、酸味和苦味，感官評(píng)價(jià)總分參照下列公式計(jì)算：

P=∑ni=1aixi。

式中：P為感官評(píng)價(jià)總得分；n為評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)目；a為權(quán)重系數(shù)；x為評(píng)價(jià)指標(biāo)得分。其中權(quán)重系數(shù)a[6]見(jiàn)表1。

表1 綜合評(píng)分權(quán)重系數(shù)Table 1 Weighting coefficients of comprehensive scores %

最終得到酶解后樣品的感官評(píng)分為20位專業(yè)感官評(píng)分員的平均分。

2 結(jié)果與討論

2.1 基本成分及酶活力分析

2.1.1 大豆分離蛋白的基本成分

本文首先對(duì)原料大豆分離蛋白進(jìn)行了基本成分測(cè)定，經(jīng)測(cè)定，大豆分離蛋白中各組分含量見(jiàn)表2。

表2 大豆分離蛋白的主要成分Table 2 Main components of soy protein isolate(SPI) %

2.1.2 幾種蛋白酶的活力分析

購(gòu)買的不同種類的蛋白酶在運(yùn)輸、儲(chǔ)存及使用過(guò)程中，會(huì)受到環(huán)境的影響，造成酶活力的損失，為了更準(zhǔn)確地比較酶解效果，本文對(duì)購(gòu)買的蛋白酶進(jìn)行了酶活的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同蛋白酶的活力Table 3 Activities of different proteases U/g

2.2 不同蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響

在各蛋白酶的最適酶解條件下對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行充分酶解，最后測(cè)得的蛋白酶水解度見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白酶種類對(duì)水解度(DH)的影響Fig.1 Effects of protease types on DH

由圖1可知，木瓜蛋白酶的水解度最低，僅為3.9%，而堿性蛋白酶的水解度最高，達(dá)到27.1%，能更好地將大豆分離蛋白分解為小分子的多肽和氨基酸，而多肽和氨基酸正是美拉德反應(yīng)制備風(fēng)味基料的前體物[7]。因此，為了得到更高的多肽和氨基酸得率，本文選擇堿性蛋白酶作為復(fù)配復(fù)合酶中的一種。

2.3 復(fù)合酶的篩選

2.3.1 復(fù)合酶種類的篩選

分別將木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶與堿性蛋白酶按相同的酶活比例進(jìn)行復(fù)配，用復(fù)配后的復(fù)合酶對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行酶解，對(duì)酶解后的產(chǎn)物進(jìn)行美拉德反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)后的風(fēng)味大豆肽進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同酶復(fù)合對(duì)風(fēng)味感官評(píng)分的影響Fig.2 Effects of different complex enzymes on flavor sensory score

由圖2 可知，風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)配酶解后制備的風(fēng)味大豆肽的風(fēng)味感官評(píng)定最好，復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶次之，中性蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)配后最差。因此，本文選擇風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)配作為復(fù)合酶，來(lái)酶解大豆分離蛋白。

2.3.2 復(fù)合酶復(fù)配比例的篩選

堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)配時(shí)，酶解液美拉德反應(yīng)后制備的大豆風(fēng)味肽的風(fēng)味最好，為了更好地確定2種酶的復(fù)配比例，本文將風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶按0.2∶1.0，0.4∶1.0，0.6∶1.0，0.8∶1.0，1.0∶1.0，1.2∶1.0，1.4∶1.0，1.6∶1.0，1.8∶1.0的酶活比例進(jìn)行復(fù)配，用復(fù)配后的復(fù)合酶對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行酶解，來(lái)探究雙酶復(fù)配比例對(duì)感官評(píng)分的影響，見(jiàn)圖3。

圖3 復(fù)合酶復(fù)配比例對(duì)風(fēng)味的影響Fig.3 Effects of ratios of complex enzymes on flavor

由圖3可知，隨著復(fù)合酶中風(fēng)味蛋白酶酶活比例的升高，制備的風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活比例為0.8∶1.0時(shí)，制備的風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分最高，為4.21。這是因?yàn)楫?dāng)風(fēng)味蛋白酶比例較低時(shí)(0.2～0.8)，風(fēng)味蛋白酶的外切作用發(fā)揮明顯，能顯著改善酶解液中呈味氨基酸和多肽的組成，從而提高酶解液美拉德反應(yīng)后的風(fēng)味[8]。當(dāng)風(fēng)味蛋白酶比例較高時(shí)(0.8～1.8)，堿性蛋白酶比例降低，其所起的水解作用減弱，蛋白質(zhì)水解度隨之降低，呈味氨基酸和多肽的含量降低，從而減弱了酶解液美拉德反應(yīng)后的風(fēng)味[9]。因此，選擇風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶比例0.8∶1.0為復(fù)合酶中2種酶的復(fù)配比例。

2.4 雙酶復(fù)合酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

當(dāng)風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶比例為0.8∶1.0時(shí)，經(jīng)美拉德反應(yīng)制備的風(fēng)味大豆肽的風(fēng)味最好，因此，本文選擇的復(fù)合酶為風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶2種酶復(fù)配而成，且其復(fù)配比例為風(fēng)味蛋白酶∶堿性蛋白酶為0.8∶1.0(以酶活計(jì))。

2.4.1 酶解溫度對(duì)風(fēng)味的影響

圖4 酶解溫度對(duì)風(fēng)味的影響Fig.4 Effects of enzymolysis temperature on flavor

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，制備的風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分不斷增加，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，感官評(píng)分最高，達(dá)到4.24，這是因?yàn)樵谳^低酶解溫度范圍內(nèi)，隨著酶解溫度增加，2種酶的酶解活力不斷升高，酶解作用加強(qiáng)，堿性蛋白酶發(fā)揮其強(qiáng)水解作用，使酶解物中氨基酸和多肽的濃度不斷增加，風(fēng)味蛋白酶的脫苦及風(fēng)味改善作用也越來(lái)越強(qiáng)，使酶解液中呈味的氨基酸和多肽的種類和含量均不斷增加，進(jìn)而使得制備的風(fēng)味大豆肽的風(fēng)味評(píng)分較高[10]。而當(dāng)酶解溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，隨著酶解溫度的不斷升高，最終的感官評(píng)分不斷下降，這是因?yàn)楫?dāng)溫度處于較高范圍時(shí)，隨著酶解溫度的不斷升高，堿性蛋白酶的酶活相對(duì)減弱，其強(qiáng)水解作用降低，導(dǎo)致最終酶解液中各類氨基酸和多肽的濃度降低，進(jìn)而影響了最終酶解液美拉德反應(yīng)后的感官評(píng)分。因此，選擇酶解溫度50 ℃為單因素實(shí)驗(yàn)的最適酶解溫度。

2.4.2 酶解pH對(duì)風(fēng)味的影響

圖5 pH對(duì)風(fēng)味的影響Fig.5 Effects of pH value on flavor

由圖5 可知，隨著pH不斷增加，美拉德反應(yīng)制備的風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH為5.0時(shí)，感官評(píng)分最低，為3.28；當(dāng)pH為7時(shí)，風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分最高，為4.54；當(dāng)pH>7.0時(shí)，隨著pH的增加，感官評(píng)分不斷降低，最后當(dāng)pH為11時(shí)，感官評(píng)分為3.52。這是因?yàn)楫?dāng)pH為7.0時(shí)，一方面風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活均相對(duì)較高，酶解作用較強(qiáng)；另一方面在該pH值下，大豆分離蛋白中一些特定的氨基酸基團(tuán)暴露在外面，有利于風(fēng)味蛋白酶的內(nèi)外切同時(shí)作用，能進(jìn)一步發(fā)揮風(fēng)味蛋白酶的脫苦和改善風(fēng)味作用[11]。因此，選擇pH 7.0為單因素實(shí)驗(yàn)的最適酶解pH。

2.4.3 酶解時(shí)間對(duì)風(fēng)味的影響

圖6 酶解時(shí)間對(duì)風(fēng)味的影響Fig.6 Effects of enzymolysis time on flavor

由圖6可知，當(dāng)酶解時(shí)間為0.5 h時(shí)，此時(shí)2種酶的作用較短，酶切作用較弱，產(chǎn)生的游離氨基酸和小分子呈味多肽較少，因此，美拉德反應(yīng)制備的風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分較低。隨著酶解時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，最終的感官評(píng)分不斷升高，酶解時(shí)間達(dá)到2.5 h時(shí)，風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分達(dá)到4.74，當(dāng)酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分趨于穩(wěn)定，不再繼續(xù)升高。這是因?yàn)榇藭r(shí)酶解時(shí)間已足夠長(zhǎng)，在2種酶的復(fù)合酶解作用下，大豆分離蛋白中可以被切割的作用位點(diǎn)已經(jīng)被作用完畢，繼續(xù)增加酶解，對(duì)游離氨基酸和小分子呈味多肽的貢獻(xiàn)不大。因此，本著降低能耗的原則，選擇2.5 h作為單因素實(shí)驗(yàn)的最適酶解時(shí)間。

2.4.4 加酶量對(duì)風(fēng)味的影響

圖7 加酶量對(duì)風(fēng)味的影響Fig.7 Effects of enzyme dosage on flavor

由圖7可知，隨著加酶量的不斷增加，制備的風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)加酶量為500 U/g時(shí)，感官評(píng)分最低，僅為3.65，隨著加酶量的不斷增加，感官評(píng)分不斷升高；當(dāng)加酶量達(dá)到2000 U/g時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到4.86，之后再增加加酶量，制備的風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分基本趨于平穩(wěn)，不再增加。這是因?yàn)榧用噶坎蛔銜r(shí)，在一定時(shí)間內(nèi)大豆分離蛋白的復(fù)合酶解作用不完全，此時(shí)，增加復(fù)合酶的加酶量，能提高酶解速率和最終酶解液中氨基酸和多肽的含量，從而使得制備的風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分提高。當(dāng)加酶量充足時(shí)，再增加復(fù)合酶的加酶量，僅僅會(huì)提高酶解初期的水解速率，無(wú)法改變最終的酶解產(chǎn)物，在此情況下繼續(xù)提高加酶量，對(duì)最終制備的風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分幾乎沒(méi)有貢獻(xiàn)。因此，選擇2000 U/g作為單因素實(shí)驗(yàn)的最適加酶量。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶解的工藝條件

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定酶解時(shí)間2.5 h，選取對(duì)酶解影響相對(duì)較大的3個(gè)因素酶解溫度、pH、加酶量，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，分別以 A，B，C表示，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表4[12]。

表4 響應(yīng)面分析法因素與水平表Table 4 Factors and levels of response surface method

響應(yīng)面試驗(yàn)分析結(jié)果見(jiàn)表5，利用Design Expert 軟件對(duì)表5 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，感官評(píng)分Y 對(duì)酶解溫度(A)、pH(B)、加酶量(C)的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=78.02-0.05A+0.42B+0.1C+0.001AB+0.001AC+0.033BC-0.31A2+0.12B2-0.079C2。

表5 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 5 The results of response surface analysis

回歸方程方差分析見(jiàn)表6。

表6 方差分析表Table 6 The table of variance analysis

續(xù) 表

注：“*”表示差異不顯著，P>0.05； “**”表示差異顯著，P<0.05；“***”表示差異極顯著，P<0.01。

由表6可知，模型極顯著(P<0.01)，一次項(xiàng)酶解溫度(A)、pH(B)、加酶量(C)極顯著；二次項(xiàng)A2，B2，C2極顯著；交互項(xiàng)AB，AC不顯著，BC極顯著；模擬方程極顯著，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.1489)。

表7 回歸方程可信度分析Table 7 The credibility analysis of regression equation

由表7可知，建立的模型具有較高的總決定系數(shù)(R2=0.9991)，同時(shí)CV值較低，具有較好的試驗(yàn)穩(wěn)定性，說(shuō)明該試驗(yàn)所得到的二次方程能夠很好地對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。由回歸方程所做的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見(jiàn)圖8～圖10。

圖8 酶解溫度和pH對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.8 Effects of enzymolysis temperature and pH on sensory score

圖9 酶解溫度和加酶量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.9 Effects of enzymolysis temperature and enzyme dosage on sensory score

圖10 pH和加酶量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.10 Effects of pH and enzyme dosage on sensory score

由圖8～圖10可知酶解溫度、pH、加酶量對(duì)制備后風(fēng)味大豆肽風(fēng)味感官評(píng)分的影響。由圖8～圖10可知，pH對(duì)風(fēng)味大豆肽風(fēng)味感官評(píng)分的影響非常顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，等高線隨其數(shù)值變化而迅速變化；加酶量和酶解溫度次之，表現(xiàn)為曲線較平緩，等高線隨其數(shù)值變化較小?；貧w模型預(yù)測(cè)感官評(píng)分最高的風(fēng)味大豆肽制備的最佳酶解工藝條件為酶解溫度49.97 ℃，pH 7.49，加酶量2167 U/g，此時(shí)的感官評(píng)分為5.45。

2.6 實(shí)驗(yàn)性驗(yàn)證

為驗(yàn)證該響應(yīng)面優(yōu)化方法的真實(shí)性，采用上述響應(yīng)面優(yōu)化的最佳酶解條件對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行酶解，為貼合實(shí)際，制定條件為酶解溫度50 ℃，pH 7.5，加酶量2167 U/g，重復(fù)酶解3次，酶解產(chǎn)物經(jīng)美拉德反應(yīng)制備風(fēng)味大豆肽，其感官評(píng)分的平均值為5.38，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為1.28%，因此采用響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

為探究最佳風(fēng)味大豆肽的制備工藝，本文以大豆分離蛋白為原料，綜合考慮水解度和感官評(píng)分，確定了風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶以0.8∶1.0進(jìn)行復(fù)配作為酶解用酶，并采用響應(yīng)面法對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，最終得出最佳酶解工藝為：風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)配比例0.8∶1.0，酶解時(shí)間2.5 h，酶解溫度50 ℃，pH 7.5，加酶量2167 U/g。在該條件下制備的風(fēng)味大豆肽的感官評(píng)分最高，為5.38。

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