郎田田，雷姝敏，陳紅

(揚州大學 旅游烹飪學院 食品科學與工程系，江蘇 揚州 225127)

杏鮑菇(Pleurotuseryngii) 的品質非常優(yōu)良,具有良好的風味、口感，并且含有豐富的營養(yǎng)物質[1]。杏鮑菇的營養(yǎng)功能性物質含量豐富、脂肪含量較少，具有較高的研究價值，近年來對杏鮑菇功能性物質的提取、開發(fā)以及利用愈發(fā)火熱[2,3]。堿溶酸沉法是提取杏鮑菇蛋白較為常用的方法，雖然此方法蛋白提取率高，但提取的蛋白質會因為提取液是強堿而發(fā)生變性，蛋白的生物活性以及其利用價值會被影響[4]。

本試驗是在上述背景的前提下進行研究的,以杏鮑菇為原料,稀NaCl溶液為提取液,超聲波輔助提取杏鮑菇粗蛋白,以期獲得最佳的提取條件,可以提高杏鮑菇及杏鮑菇內的功能性物質的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇：購于江蘇省徐州市豐縣；考馬斯亮藍、牛血清蛋白(BSA)、維生素C、NaCl：以上均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SP-756P 紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;FD-A10N-50冷凍干燥機 上海皓莊儀器有限公司;SKD-100 凱式定氮儀 上海沛歐有限公司;電腦智能溫控低溫超聲波合成萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;J25立式低溫離心機 美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 新鮮杏鮑菇的預處理方法

將杏鮑菇子實體用自來水清洗，室溫下晾干后切成體積為1 cm3的小塊，用液氮速凍后裝入保鮮袋中，保存于-80 ℃超低溫冰箱。將速凍后的杏鮑菇材料冷凍干燥，經粉碎后過80目篩，保存于有硅膠的干燥皿中備用。

1.3.2 杏鮑菇蛋白提取的單因素試驗[5,6]

1.3.2.1 NaCl溶液的濃度對蛋白提取率的影響

在杏鮑菇干粉和NaCl溶液的料液比為1∶40、溫度為40 ℃、超聲波功率為400 W的條件下,分別調整NaCl溶液的濃度為1%，2%，3%，4%，5%,反應30 min后,測定蛋白質提取率,確定最適初始NaCl溶液的濃度。

1.3.2.2 提取時間對蛋白提取率的影響

在杏鮑菇干粉和NaCl溶液的料液比為1∶40、NaCl溶液的濃度為1%、超聲波輔助溫度為40 ℃、功率為400 W的條件下,反應時間設定為10～50 min,每檔間隔10 min，反應結束后,測定蛋白質提取率,確定最適初始反應時間。

1.3.2.3 料液比對蛋白提取率的影響

在NaCl溶液的濃度為1%、超聲波輔助溫度為40 ℃、功率為400 W的條件下,設定杏鮑菇干粉和NaCl溶液的比例為1∶60，1∶50，1∶40，1∶30，1∶20,反應30 min后,測定蛋白質提取率,確定初始反應的料液比。

1.3.2.4 提取溫度對蛋白提取率的影響

在杏鮑菇干粉和NaCl溶液的料液比為1∶40、NaCl溶液的濃度為1%、超聲波輔助功率為400 W的條件下,設定溫度為20～60 ℃,每檔間隔10 ℃，反應30 min后,測定蛋白質提取率,確定最適初始溫度。

1.3.2.5 超聲波功率對蛋白提取率的影響

在杏鮑菇干粉和NaCl溶液的料液比為1∶40、NaCl溶液的濃度為1%、超聲波輔助溫度40 ℃的條件下,設置超聲波功率為200～600 W,每檔間隔100 W，反應30 min后,測定蛋白質提取率,確定最適初始超聲功率。

1.3.3 杏鮑菇蛋白質提取率的測定

使用考馬斯亮藍法來對蛋白含量進行測定，參照Bradford的方法，并做相應修改[7]。

杏鮑菇蛋白質提取率=提取液蛋白濃度×提取液體積原料質量×原料總蛋白質量分數×100%。

1.3.4 響應曲面優(yōu)化法[8]

1.3.4.1 響應面試驗設計

單因素試驗結果表明，料液比、提取溫度和提取功率是影響蛋白提取率最顯著的因素，根據Box-Behnken中心組合原理設計了響應面分析試驗，具體因素、水平見表1。

表1 超聲波提取杏鮑菇蛋白響應面分析因素和水平表Table 1 The factors and levels of response surface analysis of ultrasonic extraction for Pleurotus eryngii

1.3.4.2 響應面試驗回歸模型的建立

使用Design Expert 7.0.0軟件對試驗結果進行多元回歸分析,得到杏鮑菇蛋白提取率與料液比A、提取溫度B、提取功率C的真實值的二次回歸模型。

1.3.4.3 響應曲面分析

在簡化的回歸模型上，做料液比與溫度、料液比與功率、溫度和功率兩兩因素對杏鮑菇蛋白提取率影響顯著性的響應曲面和等高線圖，另一個因素在零水平。

2 結果與討論

2.1 單因素優(yōu)化試驗

2.1.1 NaCl濃度對蛋白質提取率的影響

蛋白提取率隨著NaCl濃度變化的結果,見圖1。

圖1 NaCl濃度對蛋白質提取率的影響Fig.1 The effect of NaCl concentration on the extraction rate of protein

NaCl濃度在0～2%范圍時,蛋白提取率隨著NaCl濃度的增加而增加,可能是由于離子濃度升高,導致蛋白表面電荷數增加,蛋白質的溶解度也隨之增加;而NaCl濃度大于 2%時,蛋白提取率卻有所降低,這可能是因為蛋白表面的電荷數已經達到飽和,高濃度NaCl的電離反而會打破蛋白分子和水分子之間的相互作用,降低蛋白的溶解性。因此,選擇 2%為初始最佳NaCl濃度。

2.1.2 提取時間對蛋白質提取率的影響

蛋白提取率隨著反應時間變化的結果,見圖2。

圖2 反應時間對蛋白質提取率的影響Fig.2 The effect of reaction time on the extraction rate of protein

當反應時間范圍在10～20 min時,蛋白質的提取率隨著時間的變長而得以提高,這可能是因為超聲波會使細胞產生強烈的振動,細胞壁被破壞,細胞內的蛋白質進入溶液,20 min恰好是細胞壁破壞的飽和時間;當反應時間達到30 min時,蛋白質的提取率達到平衡,時間過長反而會使提取率下降。因此,挑選20 min為初始超聲時間。

2.1.3 料液比對蛋白質提取率的影響

蛋白提取率隨著料液比變化的結果，見圖3。

圖3 料液比對蛋白質提取率的影響Fig.3 The effect of ratio of material to liquid on the extraction rate of protein

在料液比在1∶20～1∶30范圍時,蛋白溶解率隨著料液比的降低而升高,可能原因是在較高料液比時,提取液粘度過高阻礙了蛋白的溶解,當料液比下降時,提取液粘度和分子間作用力都有所下降,蛋白的溶解率提高;當料液比低于1∶30 時,對溶液進行稀釋已經不能提高蛋白的溶解率,達到穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。因而,選取1∶30 為初始最佳提取料液比。

2.1.4 溫度對蛋白質提取率的影響

蛋白質提取率隨著溫度變化的結果，見圖4。

圖4 溫度對蛋白質提取率的影響Fig.4 The effect of temperature on the extraction rate of protein

提取溫度在20～50 ℃時,蛋白溶解率會隨著溫度提高而明顯變高,當提取溫度高于50 ℃時,提取率反倒會有所降低。這種現(xiàn)象是因為溫度升高能夠增加蛋白質在溶液中的溶解度,而溫度再次提高時,蛋白質的疏水基團會產生反應,從而影響蛋白質的提取率。因而，挑選50 ℃為初始提取溫度。

2.1.5 超聲波功率對蛋白質提取率的影響

蛋白質提取率隨著功率的變化結果，見圖5。

圖5 超聲波功率對蛋白質提取率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on the extraction rate of protein

杏鮑菇蛋白質提取率在功率為400 W時最高,當超聲波功率提高時,溶解率先變高后不變。這是可能是因為功率的增加加強了細胞的振動反應,細胞壁更容易被破壞,胞內蛋白也更多的進入提取液;當功率高于400 W時,細胞振動反應已經飽和,不會提高蛋白溶解,反而可能會破壞已經溶出的蛋白結構。因此,選取400 W為后續(xù)試驗功率。

2.2 響應面分析法優(yōu)化試驗的結果

2.2.1 響應面試驗的結果

超聲波提取杏鮑菇蛋白響應面分析試驗的結果見表2。

表2 超聲波提取杏鮑菇蛋白響應面分析試驗的結果Table 2 Pleurotus eryngii response surface analysis results with ultrasonic extraction

續(xù) 表

2.2.2 響應面試驗回歸模型的建立

利用Design Expert 7.0.0軟件對響應面試驗結果進行多元回歸分析，得到杏鮑菇蛋白提取率與料液比A、提取溫度B、提取功率C的真實值的二次回歸模型為Y=53.37+4.85A+2.53B-1.09C+5.92AB-0.78AC-1.38BC-13.83A2-5.70B2-2.22C2。

回歸模型的方差分析結果,見表3。

表3 回歸方程模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation model

注：決定系數R2=0.9969,調整決定系數adj-R2=0.9930;*為差異顯著(P<0.05)；**為差異極顯著(P<0.01)。

模型P<0.0001,表明具有極顯著性差異,說明不同提取條件下,杏鮑菇蛋白的提取率有顯著性差異;在本試驗所選因素水平內，對提取率的影響次序為A>B>C,即料液比>提取溫度>超聲功率;A，B對模型具有極顯著性影響(P<0.01),C因素有顯著影響。各因素的交互項AB影響極顯著,表明提取溫度和料液比對杏鮑菇蛋白提取有極顯著性影響,AC對模型有顯著性影響，BC對模型影響不顯著;二次項A2，B2，C2對模型具有極顯著的影響。

2.2.3 響應曲面分析

各個因素交互的響應曲面和等高線圖見圖6～圖8。

圖6 料液比與溫度兩因素及其交互作用響應面圖和等高線圖Fig.6 The response surface and contour plot ofratio of material to liquid and temperature and the interaction

圖7 料液比與功率兩因素及其交互作用響應面圖和等高線圖Fig.7 The response surface and contour plot of ratio of material to liquid and power and the interaction

圖8 溫度和功率兩因素及其交互作用響應面圖和等高線圖Fig.8 The response surface and contour plot of temperature and power and the interaction

由圖6可知，沿溫度和料液比方向的等高線密集程度、曲面陡峭程度相當,均較密集或陡峭,闡明這兩種因素對提取率產生的影響相當,且均為顯著性影響。在提取溫度57 ℃、料液比1∶38 (g/mL)有峰值,杏鮑菇蛋白提取率最高。由圖7可知,沿料液比方向比沿功率方向等高線密集,曲面陡峭,說明料液比能夠對杏鮑菇蛋白的提取率產生顯著的影響。在提取料液比1∶38 (g/mL)、功率337 W時有峰值,杏鮑菇蛋白提取率最高。由圖8可知,沿功率方向比沿溫度方向等高線稀疏,表明溫度對杏鮑菇蛋白提取率產生顯著的影響。在提取溫度 57 ℃、功率337 W時有峰值,杏鮑菇蛋白提取率最高。

2.2.4 杏鮑菇蛋白提取工藝

在NaCl濃度2%、提取時間20 min、提取溫度57 ℃、料液比1∶38、超聲波功率340 W條件下提取率最高。過3次重復驗證試驗，蛋白質平均提取率為57.9%，工藝穩(wěn)定。

3 結論與展望

3.1 結論

本試驗以杏鮑菇為原料,超聲波輔助鹽溶法提取杏鮑菇粗蛋白。通過實驗得出以下結論：在NaCl濃度2%、提取時間20 min、提取溫度57 ℃、料液比1∶38、超聲波功率340 W條件下提取率最高，為57.9%。

3.2 展望

杏鮑菇的子實體提取物已被證實具有許多重要的生物活性,例如抗氧化活性、抗菌活性和免疫調節(jié)活性等[9,10]。通過本次研究,獲得了超聲波輔助鹽析法提取杏鮑菇蛋白的最佳條件,這種提取工藝條件較為溫和,不會對蛋白質結構和功能有較大的破壞,為今后杏鮑菇蛋白生物活性的研究提供了更多的可能,可以提高杏鮑菇及杏鮑菇內的功能性物質的開發(fā)利用[11]。

參考文獻：

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