呂志飛，連戰(zhàn)，王如娜，馮昱寧，陳靜*，劉新利

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)生物工程學院，濟南 250353；2.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)山東微生物工程重點實驗室，濟南 250353)

金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，是食品安全國家標準規(guī)定的絕大多數(shù)食品的必檢指標。乳酸鏈球菌素是我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中允許在食品中使用的微生物源防腐劑，但是乳酸鏈球菌素僅抑制引起食品腐敗的多種革蘭氏陽性菌，一般對革蘭氏陰性菌、霉菌、酵母菌沒有抑制效果。因此，若將乳酸鏈球菌素與抗真菌的物質(zhì)聯(lián)合使用，可以抑制食品中的有害細菌和真菌。

槐糖脂是一類由非致病性酵母菌產(chǎn)生的糖脂類生物表面活性劑，具有無毒、生物可降解、環(huán)境友好等優(yōu)點，在環(huán)境保護、洗滌劑及醫(yī)藥等方面展示了良好的應用前景[1-8]。近年來，對槐糖脂藥物活性的研究已有許多文獻報道，其中包括了槐糖脂的抗菌作用[9-14]。Kim等報道30 μg/mL的槐糖脂作用于大腸桿菌時，可使致病性大腸桿菌全部死亡。董永勝等報道了槐糖脂對植物源致病真菌有良好的抑制效果[15]。伏圣秘等報道了槐糖脂對水稻紋枯菌、水稻稻瘟菌和馬鈴薯晚疫病菌孢子的萌發(fā)、菌絲的生長都有明顯抑制作用[16]。Joshi-Navare等報道了當槐糖脂和抗生素聯(lián)合使用時，槐糖脂能夠增強抗生素對細菌的作用[17]。

但是，槐糖脂與乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌的抑菌作用目前未見報道。本文首先研究并比較了內(nèi)酯型槐糖脂、乳酸鏈球菌素單獨使用對金黃色葡萄球菌的抑制作用與藥物濃度、作用時間的關系；然后進一步研究了兩者聯(lián)合抑制金黃色葡萄球菌的效果。本研究為探討槐糖脂作為新型微生物源食品防腐劑以及能否與乳酸鏈球菌素聯(lián)合應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

槐糖脂生產(chǎn)菌株：假絲酵母(CandidabombicolaATCC 22214)。

抑菌實驗指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，山東省工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 藥物

內(nèi)酯型槐糖脂：本實驗室發(fā)酵制備，其主要結(jié)構見圖1。乳酸鏈球菌素：山東元泰生物工程有限公司。

圖1 內(nèi)酯型槐糖脂分子結(jié)構

1.3 方法

1.3.1 藥物溶液的配制

1.3.1.1 內(nèi)酯型槐糖脂溶液

稱取一定質(zhì)量的內(nèi)酯型槐糖脂加到蒸餾水中，反復震蕩并用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6～7之間，使內(nèi)酯型槐糖脂完全溶解，分別配制成槐糖脂濃度為10 mg/mL和1024 μg/mL的內(nèi)酯型槐糖脂藥物母液，并過濾除菌，根據(jù)實驗需要稀釋至相應濃度。

1.3.1.2 乳酸鏈球菌素溶液

稱取一定質(zhì)量的乳酸鏈球菌素于紫外燈下15 min后加到無菌水中，反復震蕩至其完全溶解，分別配制成乳酸鏈球菌素濃度為10 mg/mL和1024 μg/mL的乳酸鏈球菌素藥物母液。

1.3.2 金黃色葡萄球菌菌懸液的制備

挑取LB平板上的金黃色葡萄球菌單菌落接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，35 ℃，150 r/min培養(yǎng)6 h。取一定體積的菌液用生理鹽水稀釋至細胞濃度為108cfu/mL，為金黃色葡萄球菌菌懸液。

1.3.3 藥物對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的測定

用管碟法定性測定藥物對金黃色葡萄球菌的抑制活性。

首先，用移液槍移取100 μL菌濃為108cfu/mL的菌懸液均勻涂布于LB平板上，再用無菌鑷子夾取滅菌后的牛津杯置于涂有菌懸液的平板上，牛津杯中注入50 μL濃度分別為2.5，5，7.5，10 mg/mL的藥物溶液。小心地將平板置于4 ℃的冰箱中使藥物擴散2 h，然后置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.3.4 藥物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)

最小抑菌濃度是指微生物在特定生長環(huán)境下培養(yǎng)一定的時間，可抑制某種微生物明顯增長的最低藥物的濃度，用于定量測定體外的抗菌活性。采用美國臨床委員會(CLSI)推薦的M7-A7標準方法試管二倍稀釋法，再略加修改后進行測定，具體步驟如下：

首先，取13 mm×100 mm試管24支，每排12支，共2排，每排分別標記為1～12號。其中1～10號是藥物組，11號是空白對照組，12號是金黃色葡萄球菌陽性對照組。除第1支試管外，其余試管內(nèi)均加入LB培養(yǎng)基2 mL。分別用LB培養(yǎng)基稀釋槐糖脂母液、乳酸鏈球菌素母液，稀釋至最高濃度分別為256，8 μg/mL。然后在第1支和第2支試管中分別加入稀釋好的藥液2 mL，第2支試管混勻后吸出2 mL加到第3支試管中，依次對倍稀釋至第10支試管，吸出2 mL棄去。這樣第1排各管內(nèi)酯型槐糖脂的最終濃度依次為256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5 μg/mL，第2排各管乳酸鏈球菌素的最終濃度依次為8，4，2，1，0.5，0.25，0.12，0.06，0.03，0.015 μg/mL。用LB液體培養(yǎng)基按照1∶10的比例稀釋菌懸液(含菌量約107cfu/mL)。用移液槍準確移取0.1 mL金黃色葡萄球菌菌懸液依次由低濃度到高濃度加到2排1～10，12號試管中，最終接種菌量約為5×105cfu/mL。用移液槍分別準確移取0.1 mL LB液體培養(yǎng)基加到2排第11號試管中。35 ℃下培養(yǎng)24 h后閱讀結(jié)果，抑制檢測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對檢測菌的MIC。

1.3.5 藥物對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)

含菌量為107cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液用LB培養(yǎng)基以1∶10的方式連續(xù)稀釋4次，最后稀釋管的含菌量約為103cfu/mL。然后分別取0.1 mL加到3個LB平板上，用涂布器均勻涂布，35 ℃培養(yǎng)24 h后對平板進行菌落計數(shù)并計算其平均數(shù)N，然后計算菌落數(shù)I(I代表0.1% 最初接種菌量的菌落數(shù))，見下式：

I=N2+2N2。

將1.3.4中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)20 h后將無肉眼可見生長的各試管混勻15 s后再培養(yǎng)4 h，再次混勻后從無肉眼可見生長的各試管中分別取0.1 mL加到LB平板中，用涂布器均勻涂布，35 ℃培養(yǎng)24 h后，對每個平板進行菌落計數(shù)并計算其平均值。菌落計數(shù) ≤0.1%最初接種菌量的最低藥物濃度為該藥對檢測菌的最低(或最小)殺菌濃度。

1.3.6 藥物對金黃色葡萄球菌的抑菌動力學

采用液體培養(yǎng)抑制測定法略做修改。在菌濃為5×105cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液中分別加入一定量的內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素，使其終濃度為各自的MIC。35 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)不同時間后用紫外可見分光光度計測定600 nm處的吸光度A。以蒸餾水為對照組。按Hultmark等的方法計算抗菌活力，見下式：

U=A0-AA0。

式中：A0為初始吸光度；A為不同時間的吸光度。

1.3.7 藥物相互作用的研究

根據(jù)單藥抑菌實驗結(jié)果，按微量棋盤稀釋法略做改良進行測定，具體步驟如下：

首先，在5 mL離心管內(nèi)將內(nèi)酯型槐糖脂原液和乳酸鏈球菌素原液分別用LB液體培養(yǎng)基稀釋至256，4 μg/mL，再分別依次對倍稀釋6個濃度梯度。然后按照“棋盤”稀釋法原則組合在無菌的96孔板中加入內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素各50 μL。用LB液體培養(yǎng)基稀釋菌懸液為106cfu/mL，每孔接種100 μL。使2種藥物的最終濃度與計劃稀釋度相同，最終接種菌量為5×105cfu/mL。將96孔板置于微型振蕩器上振蕩1 min，使各孔內(nèi)溶液混勻，96孔板用封口膜密封以減少培養(yǎng)過程中的水分蒸發(fā)。35 ℃下培養(yǎng)20 h后，在每孔中加入顯色劑5 μL(5 g/L氯化三苯四氮唑)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，將96孔板放在白色背景下觀察，孔內(nèi)液體呈紅色表示菌體生長，孔內(nèi)液體呈LB液體培養(yǎng)基的顏色表示菌體生長被抑制。

分級抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration, FIC)為抗菌藥物藥效學參數(shù)之一，是2種抗菌藥的聯(lián)合藥效(2種抗菌藥同時使用時，可出現(xiàn)協(xié)同、相加、無關和拮抗4種情況)指標。

FIC=(A藥聯(lián)用時的MIC/A藥單用時的MIC)+(B藥聯(lián)用時的MIC/B藥單用時的MIC)。

FIC≤0.5，是協(xié)同作用；0.52，是拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌均有較強的抑制作用，且抑菌圈直徑隨著2種藥物濃度的增加而增大，最大抑菌圈直徑分別為10.50，21.30 mm，呈濃度依賴性。乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯強于內(nèi)酯型槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑制作用。同一藥物濃度下，乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大約是內(nèi)酯型槐糖脂對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的2倍，見圖2和表1。

圖2 藥物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

注：a為空白對照，b為內(nèi)酯型槐糖脂，C為乳酸鏈球菌素。

表1 藥物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑(N=4)

2.2 藥物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

圖3 藥物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

注：S為內(nèi)酯型槐糖脂，L-SLs；N為乳酸鏈球菌素，Nisin。

圖3中S是內(nèi)酯型槐糖脂對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度實驗結(jié)果。由圖3中S可知，1～4號試管澄清，5～10號試管渾濁，11號試管澄清，12號試管渾濁。因此，抑制金黃色葡萄球菌肉眼可見生長的最低藥物濃度為4號試管對應的內(nèi)酯型槐糖脂濃度，即32 μg/mL。所以，內(nèi)酯型槐糖脂對金黃色葡萄球菌的MIC值為32 μg/mL。

圖3中N是乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度實驗結(jié)果。由圖3中N可知，1～5號試管澄清，6～10號試管渾濁，11號試管澄清，12號試管渾濁。因此，抑制金黃色葡萄球菌肉眼可見生長的最低藥物濃度為5號試管對應的乳酸鏈球菌素濃度，即0.5 μg/mL。所以，乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的MIC值為0.5 μg/mL。

2.3 藥物對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度

金黃色葡萄球菌在35 ℃培養(yǎng)24 h后對平板進行菌落計數(shù)，得出菌落數(shù)N=40，然后代入I值的計算公式，求得代表0.1%最初接種菌量的菌落數(shù)I值為28。

表2 藥物對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(N=3)

由表2可知，菌落計數(shù)≤28的平板所對應的內(nèi)酯型槐糖脂試管編號為1#，2#，3#，所對應的乳酸鏈球菌素試管編號為1#，2#，3#，4#。根據(jù)最小殺菌濃度的定義得出，內(nèi)酯型槐糖脂對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度為64 μg/mL；乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度為1 μg/mL。

2.4 藥物對金黃色葡萄球菌的抑菌動力學

利用液體體外抑菌實驗，測定內(nèi)酯型槐糖脂、乳酸鏈球菌素的活性與作用時間的關系，即抑菌藥物的抑菌動力學。實驗結(jié)果表明：內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素的藥物活性隨作用時間延長均呈先上升后下降再趨于平穩(wěn)的趨勢。兩者均在0～1 h出現(xiàn)一個活性峰，1 h之后活性下降，隨后一直趨于穩(wěn)定，見圖4。

圖4 藥物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性與作用時間的關系

2.5 藥物的相互作用研究

根據(jù)抑菌圈直徑以及MIC值的測定結(jié)果，采用微量棋盤稀釋法對內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素進行聯(lián)合抑菌活性研究，并以FIC值進行效果評價。內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素聯(lián)合抑菌效果見圖5。內(nèi)酯型槐糖脂聯(lián)用時的MIC為16 μg/mL，內(nèi)酯型槐糖脂單用時的MIC為32 μg/mL，乳酸鏈球菌素聯(lián)用時的MIC為0.5 μg/mL， 乳酸鏈球菌素單用時的MIC為0.5 μg/mL，然后代入FIC值的計算公式，求得FIC值為1.5，1<1.5<2，內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用表現(xiàn)出無關作用。

圖5 內(nèi)酯型槐糖脂與乳酸鏈球菌素的藥物相互作用

注：A，B為2次平行實驗。

3 討論與結(jié)論

槐糖脂是一種微生物源的表面活性劑，具有降低表面張力、乳化、分散、增溶等作用，可以應用在食品加工過程中改善食品性狀、口味和品質(zhì)，槐糖脂不但能抑制細菌，也能抑制真菌，可以同時對食品起到防腐保鮮功能。因此有望開發(fā)成一種食品添加劑，既可以改善食品性狀和口味從而提高品質(zhì)，又可以防腐保鮮。一種添加劑能夠達到兩種目的，從而減少食品添加劑的使用種類。

槐糖脂既可以單獨使用，也可以與其他藥物聯(lián)合使用。已有文獻報道槐糖脂與臨床藥物聯(lián)合使用的效果。Sanada等報道槐糖脂作為皮膚吸收促進劑能夠促進聚六亞甲基雙胍的皮膚滲透而增強抗真菌作用[18]。Joshi-Navare等報道槐糖脂與四環(huán)素、槐糖脂和頭孢克洛聯(lián)合使用時，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制呈現(xiàn)協(xié)同增效作用。但是，槐糖脂與乳酸鏈球菌素的聯(lián)合應用未見報道。

乳酸鏈球菌素是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的由多種氨基酸組成的多肽類化合物，是一種無毒的天然防腐劑，廣泛應用于乳制品、罐頭制品、魚類制品、飲料等食品中。乳酸鏈球菌素能有效抑制引起食品腐敗的多種革蘭氏陽性細菌，如金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、李斯特氏菌等，其抗菌作用是通過干擾細胞膜的正常功能，造成細胞膜的滲透、養(yǎng)分流失和膜電位下降，從而導致致病菌和腐敗菌的死亡。

本文研究了內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素單獨使用以及兩者聯(lián)合使用，不同情況下對金黃色葡萄球菌的抑制活性，探討槐糖脂單獨使用和兩者聯(lián)合應用到食品中的可能性。

研究表明：內(nèi)酯型槐糖脂和乳酸鏈球菌素單獨使用時都能夠在短時間內(nèi)有效抑制金黃色葡萄球菌的生長繁殖，且表現(xiàn)出較小的MIC值，分別為32，0.5 μg/mL。雖然乳酸鏈球菌素的抑菌活性稍強，但槐糖脂單獨應用到食品中能夠達到防腐保鮮和改良食品兩種目的。本研究首次證明槐糖脂與乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌的抑制表現(xiàn)出無關作用，沒有表現(xiàn)出拮抗作用。該結(jié)果與Joshi-Navare等報道的槐糖脂與四環(huán)素、槐糖脂與頭孢克洛的協(xié)同增效作用不一致，可能原因是四環(huán)素和頭孢克洛都是廣譜抗生素，抗菌能力強，而乳酸鏈球菌素只抑制革蘭氏陽性細菌?；碧侵腿樗徭溓蚓芈?lián)合使用不表現(xiàn)出拮抗作用，說明二者聯(lián)合應用具有可能性。

本研究證明了槐糖脂單獨使用與槐糖脂和乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌具有很強的抑制作用，且槐糖脂和乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用不表現(xiàn)出拮抗作用，有望開發(fā)成槐糖脂食品添加劑和復合食品添加劑。

參考文獻：

[1]Mulligan C N.Environmental applications for biosurfactants[J].Environ Pollut,2005,133:183-198.

[2]Sun X X,Choi J K,Kim E K.A preliminary study on the mechanism of harmful algal bloom mitigation by use of sophorolipid treatment[J].J Exp Mar Biol Ecol,2004,304:35-49.

[3]Singh P,Cameotra S S.Potential applications of microbial surfactants in biomedical sciences [J].Trends in Biotechnol,2004,22:142-146.

[4]Cameotra S S,Makkar R S.Recent applications of biosurfactants as biological and immunological molecules[J].Curr Opin Microbiol,2004(7):262-266.

[5]Mulligan C N,Yong R N,Gibbs B F.Remediation technologies for metal contaminated soils and groundwater:an evaluation [J].Eng Geol,2001,60:193-207.

[6]Mulligan C N,Yong R N,Gibbs B F.Removal of heavy metals from contaminated soil and sediments using the biosurfactant surfactin [J].J Soil Contam,1999(8):231-254.

[7]Sun X X,Lee Y J,Choi J K,et al.Synergistic effect of sophorolipid and loess combination in harmful algal blooms mitigation[J].Mar Pollut Bull,2004,48:863-872.

[8]袁兵兵,楊姍姍,陳靜.微生物源槐糖脂對水果致腐真菌的抑制作用[J].應用與環(huán)境生物學報,2011,17(3):330-333.

[9]Bogaert V,Saerens K,Muynck D C,et al.Microbial production and application of sophorolipids [J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,76:23-34.

[10]Chen J,Song X,Qu Y B,et al.Studies on optimization of sophorolipid fermentation by yeast strain Y2A and antimicrobial activity of sophorolipid [J].Shandong Univ Nat Sci,2005,40(3):116-120.

[11]Yoo D S,Lee B S,Kim E K.Characteristics of microbial biosurfactant as an antifungal agent against plant pathogenic fungus[J].Microbiol Biotechnol,2005,15(6):1164-1169.

[12]Kim K J,Yoo D,Kim Y,et al.Characteristics of sophorolipid as an antimicrobial agent[J].Microbiol Biotechnol,2002,12(2):235-241.

[13]Shah V,Badia D,Ratsep P.Sophorolipids having enhanced antibacterial activity [J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2007,51(1):397-400.

[14]Dengle-Pulate V,Chandorkar P,Bhagwat S,et al.Antimicrobial and SEM studies of sophorolipids synthesized using lauryl alcohol[J].Journal of Surfactants and Detergents,2014,17(3):543-552.

[15]董永勝,袁兵兵,陳靜.槐糖脂對水果致腐菌的抗菌作用及新型防腐保鮮劑的開發(fā)[D].濟南： 山東輕工業(yè)學院,2011.

[16]伏圣秘,陳靜.槐糖脂對作物病原真菌的抗菌作用及其新型生物殺菌劑的開發(fā)[D].濟南：齊魯工業(yè)大學,2014.

[17]Joshi-Navare K,Prabhune A.A biosurfactant-sophorolipid acts in synergy with antibiotics to enhance their efficiency[J].BioMed Research International,2013,2013:1-8.

[18]Sanada H,Nakagami G,Takehara K,et al.Antifungal effect of non-woven textiles containing polyhexamethylene biguanide with sophorolipid:a potential method for tinea pedis prevention [J].Health Care,2014(2):183-191.