郭豐源，王博文，李文鵬，牛秋紅

(1.河南鄭州外國語學(xué)校,河南鄭州 450006；2.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南南陽 473061)

冬小麥和夏玉米輪作是我國北方地區(qū)傳統(tǒng)的種植方式，在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用非常廣泛。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最為活躍的部分,參與90%左右的土壤反應(yīng)過程，如有機(jī)質(zhì)降解、腐殖質(zhì)合成和養(yǎng)分循環(huán)等，在土壤物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)及維持土壤生態(tài)系統(tǒng)多樣性與穩(wěn)定性方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1-4]。研究表明，合理的輪作可以有效改善土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)和豐度，有利于提高土壤微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性，改善土壤肥力，減少作物病蟲害的發(fā)生[5-7]。微生物不僅廣泛存在于土壤，而且可以棲息在植物表面及內(nèi)部組織上，在植物生長與發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[8-10]。植物與微生物在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，相互并存，相互制約，形成了一種動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系[11]。然而，土壤中的微生物只有少部分可以通過篩選、純培養(yǎng)的方法獲得，大部分微生物在現(xiàn)有的條件下極難或者無法培養(yǎng)成功，使得許多土壤微生物包含的大量遺傳信息難以被發(fā)現(xiàn)[12]。

20世紀(jì)80年代以來，由于PCR克隆文庫、RAPD、SSCP、RFLP、AFLP、DGGE/TGGE和T-RFLP等微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法的逐步建立，可以避開傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)過程，直接探討土壤微生物的菌群結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境的關(guān)系[13-15]，使土壤根際微生物多樣性、微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能、系統(tǒng)發(fā)育與分類、土壤微生物與土壤的相互作用及其影響等多領(lǐng)域的研究得以突破[13-14]。近年來，以454和Illumina Miseq為代表的高通量測(cè)序以其測(cè)序通量高、分析平臺(tái)方便快捷，迅速成為研究土壤微生物多樣性的最重要手段[16-17]。通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序和分析，已經(jīng)使玉米、番茄、水稻、大豆等植物根際土壤和根內(nèi)生細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)組成和多樣性得到深入和全面了解[8,11,17-19]。常規(guī)的454和Miseq測(cè)序平臺(tái)得到的序列長度一般在400～500 bp，只能覆蓋細(xì)菌16S rRNA基因序列1～2個(gè)可變區(qū)，在分類鑒定上不足以精確鑒定到種屬，多被用于植物細(xì)菌在門和目水平的分類及其多樣性分析[15,20]。

河南是我國小麥和玉米主產(chǎn)區(qū)，小麥產(chǎn)量約占全國的27%，玉米約占14%[5]。為了解小麥-玉米輪作體系對(duì)土壤細(xì)菌及其多樣性的影響，本試驗(yàn)采用PCR克隆文庫構(gòu)建、克隆測(cè)序并結(jié)合基于高通量測(cè)序的生物信息學(xué)分析技術(shù)以及校正的EzBioCloud 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫[21-22]，研究河南典型的冬小麥-夏玉米輪作農(nóng)田中土壤細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)組成、核心菌群及其變化，以期深入了解農(nóng)田土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成、動(dòng)態(tài)變化及其與植物生長的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

試驗(yàn)設(shè)于河南省魯山縣張官營鎮(zhèn)白杜孫村，供試田塊屬于典型的小麥-玉米輪作農(nóng)田，至少有20年以上的小麥-玉米輪作種植歷史。分別在2015年3月14日(初春冬小麥返青期，記為516)、2015年6月6日(冬小麥?zhǔn)崭詈笥衩讋偛シN，記為716)和2015年7月18日(夏玉米拔節(jié)期，記為816)采集土樣。按S形在大田內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)位點(diǎn),每個(gè)點(diǎn)采集5～8 cm土層距植物根2 cm左右的土樣0.1 kg,混合后置于密閉塑料袋中,帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 細(xì)菌總基因組DNA的提取

稱取1 g土樣，利用土壤基因組DNA提取試劑盒(Catalog #12800-50,MOBIO,USA)，按試劑盒操作說明進(jìn)行土壤細(xì)菌總基因組DNA的提取和純化。提取的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠100 V電泳45 min，檢測(cè)其大小、純度和濃度。提取的基因組保存于-80 ℃低溫冰箱。

1.3 細(xì)菌16S rRNA 基因的擴(kuò)增和文庫構(gòu)建

將1.2中提取的土壤細(xì)菌總基因組DNA稀釋10倍為模板，采用細(xì)菌通用引物:27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGYTACCTTGTKWCGACTT-3′)擴(kuò)增土壤細(xì)菌16S rRNA基因[23]。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,59 ℃ 40 s,72 ℃ 2 min,30個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，通過TA克隆技術(shù)連接至pMD18-T載體(購自TaKaRa)，轉(zhuǎn)化至Escherichiacoli DH-5α感受態(tài)中(購自TaKaRa),涂于添加X-Gal、IPTG和氨芐青霉素的LB平板上，獲得細(xì)菌16S rRNA基因文庫。

1.4 16S rRNA 基因克隆文庫的篩選、測(cè)序、數(shù)據(jù)處理和OTU聚類

從16S rRNA基因文庫中隨機(jī)挑取白色克隆,采用載體引物M13RV-P(5′-GGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3′)和M13-20(5′-CGA CGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′)進(jìn)行菌落PCR。挑取陽性克隆送至上海生工，以細(xì)菌16S rRNA基因上游引物27f為引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后經(jīng)DNASTAR Lasergene 8軟件包的SeqMan程序trim，去除兩端低質(zhì)量序列和載體序列，獲得的高質(zhì)量16S rRNA基因序列，進(jìn)一步參考原始測(cè)序圖譜對(duì)序列中的非ATCG堿基進(jìn)行人工校對(duì)并去除重疊峰序列。根據(jù)Chun等[21-22]的方法，通過QIIME分析除去嵌合序列。為了減小樣品序列數(shù)目不同對(duì)分析結(jié)果的影響，以樣品序列數(shù)目最小值為準(zhǔn)對(duì)三個(gè)樣品序列數(shù)目統(tǒng)一隨機(jī)抽平。按QIIME要求的數(shù)據(jù)格式對(duì)抽取的序列進(jìn)行標(biāo)記和整理，以相似性≥97%的序列作為一個(gè)OTU，通過QIIME對(duì)所有樣品的抽取序列進(jìn)行OTU聚類。每一個(gè)OTU取最豐富序列作為該OTU的代表性序列。分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的OTUs數(shù)目和克隆數(shù)，并計(jì)算樣品alpha多樣性指數(shù),包括樣品的香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、Chao指數(shù)、辛普森指數(shù)(Simpson)以及飽和曲線等。

1.5 細(xì)菌的分類、比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將每一個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的16S rRNA基因代表性序列與校正的EzBioCloud 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,鑒定其分類地位，計(jì)算每一樣品的菌群結(jié)構(gòu)組成。收集每一個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的代表性序列，通過SeaView的ClustalX 程序進(jìn)行完全比對(duì)。編輯后用SeaView的tree程序構(gòu)建PhyML系統(tǒng)進(jìn)化樹[24]，對(duì)比各個(gè)OTU的豐度值。

本研究中得到的所有細(xì)菌16S rRNA基因序列已提交到GenBank核酸數(shù)據(jù)庫,序列號(hào)為MF002140～MF002365。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌16S rRNA基因文庫克隆的測(cè)序和分析

分別從構(gòu)建的細(xì)菌16S rRNA基因文庫平板上隨機(jī)挑取大約150個(gè)左右的白色菌落，經(jīng)PCR驗(yàn)證為陽性后測(cè)序。最終從三個(gè)克隆文庫中一共得到445個(gè)陽性克隆，其中，從樣品516中得到148個(gè)陽性菌落，有102個(gè)測(cè)序成功；從樣品716中得到144個(gè)陽性菌落，有89個(gè)測(cè)序成功；從樣品816中得到153個(gè)陽性菌落，有73個(gè)測(cè)序成功。測(cè)序成功的16S rDNA序列長度主要分布在550～750 bp之間，最長為734 bp，最短549 bp，平均長度702 bp，覆蓋了16S rRNA基因的V1-V4可變區(qū)。716、816樣品測(cè)序成功率較低，很可能和購買的感受態(tài)細(xì)胞在低溫冰箱保存一段時(shí)間后效率下降，或者PCR產(chǎn)物純化不徹底導(dǎo)致構(gòu)建文庫中假陽性克隆增多有關(guān)。

2.2 細(xì)菌16S rRNA基因的OTU聚類分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)人工校對(duì)后得到259條高質(zhì)量序列，通過QIIME分析鑒定并除去嵌合序列15條，最終得到244條有效序列，其中，樣品516有效序列90條，樣品716有效序列85條，樣品816有效序列有69條。對(duì)所有樣品的全部有效序列進(jìn)行OTU聚類，結(jié)果顯示，三個(gè)土壤樣品中總共得到190個(gè)OTUs，其中，樣品516的OTUs數(shù)量為75，樣品716的OTUs數(shù)量為76，樣品816的OTUs數(shù)量為63。以樣品數(shù)目最少的816為標(biāo)準(zhǔn)將三個(gè)樣品的序列數(shù)目都按69條序列抽平，重新聚類后三個(gè)樣品的OTUs數(shù)目分別為58、63和63(表1)。

隨著被測(cè)序列數(shù)目的增加，Shannon指數(shù)曲線趨于平坦，表明本試驗(yàn)中測(cè)序深度基本可以反映樣品中細(xì)菌多樣性和結(jié)構(gòu)組成的真實(shí)情況。三個(gè)樣本的Chao指數(shù)表達(dá)的物種豐富度以及Shannon和Simpson表達(dá)的細(xì)菌多樣性均存在一定的差異，其中，716和816的物種多樣性和豐富度較516高，推測(cè)隨著氣溫升高細(xì)菌在土壤中的多樣性和豐富度逐漸升高。

表1 不同土壤樣品的細(xì)菌菌群多樣性指數(shù)Table 1 Diversity indices of bacteria from soil of different samples

516:冬小麥返青期樣品；716:小麥-玉米間隔期樣品；816:玉米拔節(jié)期樣品。表中OUT數(shù)目是指三個(gè)樣品序列數(shù)目均為抽平后(69條)觀察得到的OTU數(shù)目。下同。

516:Sample at jointing stage of wheat; 716:Sample at rotation interval; 816:Sample at jointing stage of maize. Observed OTU listed in the table refers to the observed OTU numbers in the three samples after subsamples(69 sequences). The same below.

基于OTU數(shù)目的熱圖(圖1)，三個(gè)樣品之間的OTUs種類和分布具有較高的重疊和一致性，表明在小麥-玉米輪作體系中，不同時(shí)期土壤細(xì)菌的組成較穩(wěn)定。但不同樣品豐度最高的OTUs所屬細(xì)菌種類及其豐度明顯不同，樣品816 OTUs種類和多樣性最高，樣品516次之，而樣品716 OTUs種類和多樣性最低。這可能與隨著氣溫升高和農(nóng)事活動(dòng)增多細(xì)菌在土壤中的積累量增加有關(guān)，說明不同時(shí)期土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群和物種多樣性不同。

圖1 不同土壤細(xì)菌的OTUs熱圖Fig.1 Heatmap indicating the abundant OUTs of bacteria from different soils

2.3 不同時(shí)期土壤細(xì)菌群落數(shù)量與組成

對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因序列的分類鑒定結(jié)果(圖2)表明，在門水平上，三個(gè)土壤樣品細(xì)菌菌群組成基本一致，主要由變形菌門Proteobacteria(33.73%)、擬桿菌門Bacteroidetes(31.50%)、酸桿菌門Acidobacteria(9.28%)、疣微菌門Verrucomicrobia(5.84%)、浮霉菌門Planctomycetes(3.50%)和放線菌門Actinobacteria(1.96%)組成，但不同樣品細(xì)菌類群的豐度和比例略有不同。在目水平上，主要的優(yōu)勢(shì)菌群包括擬桿菌門的Sphingobacteriales(鞘脂桿菌目)、Flavobacteriales(黃桿菌目)、Cytophagales(噬纖維菌目)，變形菌門的Steroidobacter、Rhodospirillales(紅螺菌目)、Sphingomonadales(鞘脂單胞菌目)，以及其他酸桿菌門和疣微菌門的一些細(xì)菌目。核心OTUs分析表明，Sphingobacteriales、Flavobacteriales、Cytophagales、Steroidobacter、Sphingomonadales為小麥-玉米輪作體系中土壤細(xì)菌的核心菌群。總體而言，小麥-玉米輪作體系不同時(shí)期土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群構(gòu)成較穩(wěn)定，Proteobacteria和Bacteroidetes是最主要的優(yōu)勢(shì)菌群，構(gòu)成Proteobacteria的細(xì)菌目組成和比例變化較大，而Bacteroidetes相對(duì)穩(wěn)定

冬小麥拔節(jié)期土壤樣品(516)中，豐度最高的是Proteobacteria，占35.56%，其次為Bacteroidetes，占31.11%。構(gòu)成Proteobacteria的細(xì)菌主要包括Alpha、Beta、Gamma、Delta -Proteobacteria下的十幾個(gè)目，其中，Steroidobacter和Sphingomonadales為主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目，所占比例分別為7.78%和5.56%，其余目的細(xì)菌所占比例在1%～3%之間。構(gòu)成Bacteroidetes的細(xì)菌菌群相對(duì)集中，主要包括三個(gè)目，以Sphingobacteriales豐度最高(21.11%)，其次為Flavobacteriales(4.44%)和Cytophagales(3.33%)(圖3和圖4)。Acidobacteria(14.44%)、Actinobacteria(4.44%)和Gemmatimonadetes(7.78%)三個(gè)門細(xì)菌在516樣品中的占比明顯高于其他兩個(gè)樣品?？偟膩碚f，樣品516的優(yōu)勢(shì)菌群主要包括Bacteroidetes的Chitinophagaceae(噬幾丁質(zhì)菌科)、Flavobacteriaceae(黃桿菌科)、Sphingobacteriaceae(鞘脂桿菌科)，變形菌門的Steroidobacter、Caulobacteraceae(柄桿菌科)、Sphingomonadaceae(鞘脂單胞菌科)以及一個(gè)未知的酸桿菌菌群和Gemmatimonadales。

圖2 不同土壤樣品在門水平上細(xì)菌組成圖Fig.2 Charts of major bacterial taxa at phylum level in different soil samples

圖3 小麥-玉米輪作體系中不同土壤樣品在目水平上細(xì)菌組成柱狀圖Fig.3 Bar charts of major bacterial taxa in wheat-maize rotation soil samples

在輪作間隔期土壤樣品(716)中，主要優(yōu)勢(shì)菌仍為Proteobacteria和Bacteroidetes，所占總OTUs比例分別為32.94%和29.41%，其中，Proteobacteria中，Rhodospirillales(4.71%)、Steroidobacter(3.53%)、 Burkholderiales(伯克霍爾德目)(2.35%)三個(gè)目豐度最高；而Bacteroidetes的主要優(yōu)勢(shì)目仍為Sphingobacteriales(11.76%)、Flavobacteriales(10.59%)、Cytophagales(5.8%)，但是相對(duì)樣品516，Sphingobacteriales OTUs所占比例下降明顯。其他優(yōu)勢(shì)菌群依次為Verrucomicrobia(4.71%)、Acidobacteria(4.71%)、Parcubacteria(4.71%)和Planctomycetes(4.71%)等(圖3和圖4)。在科水平上，豐度較高的細(xì)菌類群為Cytophagaceae(噬纖維菌科)，占10.59%，Chitinophagaceae占9.41%，Steroidobacter占3.53%，Pedosphaera占3.53%，Rhodospirillaceae(紅螺菌科)占3.53%，F(xiàn)lavobacteriaceae占2.35%。

在夏玉米拔節(jié)期樣品(816)中，土壤優(yōu)勢(shì)菌為Proteobacteria和Bacteroidetes，所占比例分別占 36.63%和30.43%。Proteobacteria中豐度較高的目主要為Steroidobacter，占4.35%，Chromatiales(著色菌目)占 4.35%，Burkholderiales占2.35%，Xanthomonadales(黃色單胞菌目)占4.35%，Rhodospirillales占2.90%。Bacteroidetes主要為Sphingobacteriales占18.84%，F(xiàn)lavobacteriales占2.90%，Cytophagales占7.25%。其他主要的細(xì)菌門依次為Acidobacteria占8.70%， Verrucomicrobia占7.25%，Planctomycetes占5.85%等(圖3和圖4)。在科水平上主要的優(yōu)勢(shì)菌群為Chitinophagaceae，占18.84%，Cytophagaceae占7.25%，Steroidobacter占4.35%，Xanthomonadaceae(黃色單胞菌科)占4.35%，Pedosphaera占2.90%和Gemmatimonadaceae(芽單胞菌科)占2.90%等。

圖4 三個(gè)土壤樣品OTU代表性序列的系統(tǒng)聚類分析Fig.4 Phylogenetic analysis of OTU_based sequences in the three soil samples

2.4 小麥-玉米輪作體系中土壤細(xì)菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

190個(gè)OTUs的代表性序列的聚類分析表明，Proteobacteria和Bacteroidetes是小麥-玉米輪作體系中土壤細(xì)菌的主要優(yōu)勢(shì)類群，多樣性也最為豐富，其次為Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Actinobacteria和Verrucomicrobia等(圖5)。構(gòu)成Bacteroidetes主要的三個(gè)目為Sphingobacteriales、Flavobacteriales和Cytophagales；構(gòu)成變形菌門的十幾個(gè)細(xì)菌目廣泛分布在Alpha、Beta、Gamma、Delta4個(gè)變形菌綱中，三個(gè)不同時(shí)期豐度較高的菌群組成變化較大。

3 討 論

近年來，454和Miseq高通量測(cè)序已經(jīng)成為研究土壤微生物多樣性的重要手段，以Mothur和QIIME為主的分析平臺(tái)的完善和成熟，使不同環(huán)境下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的認(rèn)識(shí)越來越全面和深入[17-19,25-26]。目前，主流的二代測(cè)序讀長已經(jīng)可以做到400～500 bp，可以覆蓋細(xì)菌16S rRNA基因的1～2兩個(gè)可變區(qū)。但是由于讀長較短，在分類鑒定的精確度上有較大的不足[20,27]。

目前，獲得細(xì)菌較長16S rRNA基因序列的方法主要有兩種，一是通過傳統(tǒng)的構(gòu)建分子克隆文庫并挑單克隆測(cè)序，另外一個(gè)是基于三代測(cè)序的PacBio，后者由于錯(cuò)配率高目前尚無大規(guī)模應(yīng)用。本研究在傳統(tǒng)的構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫挑選克隆測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用QIIME生物信息學(xué)分析平臺(tái)，以及經(jīng)過校正的EzBioCloud 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫[21-22]，對(duì)河南冬小麥-夏玉米輪作體系中土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成、核心菌群變化以及多樣性進(jìn)行分析。根據(jù)對(duì)190條OTUs代表性序列的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)187條序列可以注釋到屬的水平，根據(jù)對(duì)比這些序列在RDP數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫blast的結(jié)果，驗(yàn)證了注釋的可靠性。證明傳統(tǒng)的克隆文庫測(cè)序結(jié)合有效的生物信息學(xué)分析方法和可靠地16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫可以有效地改善對(duì)土壤樣品細(xì)菌分類的注釋結(jié)果[21,27]。

在調(diào)查的三個(gè)不同時(shí)期玉米-小麥輪作體系土壤樣品中，Proteobacteria、Bacteroidetes和Acidobacteria是主要的優(yōu)勢(shì)菌群，與Bulgarelli等[28]對(duì)不同土壤和不同品系擬南芥根際和田間土壤細(xì)菌組成的研究結(jié)果相似。Peiffer等[8]對(duì)27個(gè)玉米品種根際土壤細(xì)菌的研究結(jié)果也表明，Proteobacteria，尤其是Burkholderiales在玉米根際土壤中高度富集。Tian等[17]和Edwards等[18]對(duì)番茄和大豆的工作也表明Proteobacteria、Bacteroidetes和Acidobacteria細(xì)菌在植物根際和田間土壤細(xì)菌中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。本研究中，三個(gè)不同時(shí)期土壤樣品中細(xì)菌組成和多樣性稍有不同，其中，Bacteroidetes細(xì)菌組成集中并且相對(duì)穩(wěn)定，主要由Sphingobacteriales、Flavobacteriales和Cytophagales組成。而變形菌門細(xì)菌菌群組成差異較大，主要包括Steroidobacter、Sphingomonadales、Rhizobiales、Rhodospirillales和Burkholderiales等。研究表明，土壤微生物群落組成與多樣性受植被類型影響，合理的輪作模式可以在很大程度上改善土壤微生物組成和多樣性[5-6]。本研究證明，在冬小麥、玉米生長期內(nèi)，細(xì)菌的豐度和多樣性明顯高于二者的間隔期，且在玉米種植期間細(xì)菌豐度和多樣性更高。不同的微生物群落在土壤中擔(dān)負(fù)不同的生態(tài)系統(tǒng)功能，豐富的微生物種類和多樣性表明土壤內(nèi)更為活躍的生理和代謝活性。深入了解細(xì)菌與植物生長之間的密切聯(lián)系，尋找具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物，研發(fā)新型無公害農(nóng)藥，對(duì)減少傳統(tǒng)的農(nóng)藥使用、改善農(nóng)業(yè)環(huán)境具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] COLEMAN D C,CROSSLEY D A,HENDRIX P F.Fundamentals of soil ecology [M].London:Academic Press,1996:49.

[2] KONOPKA A,OLIVER L,TURCO R F.The use of carbon substrate utilization patterns in environmental and ecological microbiology [J].MicrobialEcology,1998,35(2):108.

[3] PANKHURST C E,OPHEL-KELLER K,DOUBE B M,etal.Biodiversity of soil microbial communities in agricultural systems [J].Biodiversity&Conservation,1996,5(2):202.

[4] 賀紀(jì)正,李 晶,鄭袁明.土壤生態(tài)系統(tǒng)微生物多樣性-穩(wěn)定性關(guān)系的思考 [J].生物多樣性,2013,21(4):412.

HE J Z,LI J,ZHENG Y M.Thoughts on the microbial diversity-stability relationship in soil ecosystems [J].BiodiversityScience,2013,21(4):412.

[5] 全 鑫,楊艷艷,梁 娟,等.小麥-玉米輪作一體化保護(hù)栽培期間土壤微生物群落變化 [J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2016,32(12):133.

QUAN X,YANG Y Y,LIANG J,etal.Soil microflora change during integrated protection cultivation of wheat-maize rotation [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2016,32(12):133.

[6] YUSUF A A,ABAIDOO R C,IWUAFOR E N O,etal.Rotation effects of grain legumes and fallow on maize yield,microbial biomass and chemical properties of an alfisol in the Nigerian savanna [J].Agriculture,Ecosystems&Environment,2009,129:325.

[7] 李 花,葛瑋健,馬曉霞,等.小麥-玉米輪作體系長期施肥對(duì)(土婁)土微生物量碳、氮及酶活性的影響 [J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2011,17(5):1141.

LI H,GE W J,MA X X,etal.Effects of long-term fertilization on carbon and nitrogen and enzyme activities of soil microbial biomass under winter wheat and summer maize rotation system [J].PlantandFertilizerScience,2011,17(5):1141.

[8] PEIFFER J A,SPOR A,KOREN O,etal.Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2013,110(16):6548.

[9] TIAN B Y,YANG J K,ZHANG K Q.Bacteria used in biological control of plant-parasitic nematodes:Populations,mechanisms of action,and future prospects [J].FEMSMicrobiologyEcology,2007,61:201.

[10] BERENDSEN R L,PIETERSE C M,BAKKER P A.The rhizosphere microbiome and plant health [J].TrendsinPlantScience,2012,17(8):478.

[11] TURNER T R,JAMES E K,POOLE P S.The plant microbiome [J].GenomeBiology,2013,14:209.

[12] AMANN R I,LUDWIG W,SEHLEIFER K H,etal.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation [J].MicrobiologicalReviews,1995,59(1):144.

[13] SMALLAA K,OROS-SICHLERA M,MILLINGA A,etal.Bacterial diversity of soils assessed by DGGE,T-RFLP and SSCP fingerprints of PCR-amplified 16S rRNA gene fragments:Do the different methods provide similar results [J].JournalofMicrobiologicalMethods,2007,69(3):471.

[14] 李世貴,呂天曉,顧金剛,等.土壤微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法 [J].中國土壤與肥料,2008(6):2.

LI S G,Lü T X,GU J G,etal.The research methods in soil microbial molecular ecology [J].SoilandFertilizerSciencesinChina,2008(6):2.

[15] 李曉然,呂 毅,宮路路,等.微生物分子生態(tài)學(xué)發(fā)展歷史及研究現(xiàn)狀 [J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2012,24(4):367.

LI X R,Lü Y,GONG L L,etal.The development history and research progress of molecular microbial ecology [J].ChineseJournalofMicroecology,2012,24(4):367.

[16] 魏子艷,金德才,鄧 曄.環(huán)境微生物宏基因組學(xué)研究中的生物信息學(xué)方法[J].微生物學(xué)通報(bào),2015,42(5):897.

WEI Z Y,JIN D C,DENG Y.Bioinformatics tools and applications in the study of environmental microbial metagenomics [J].MicrobiologyChina,2015,42(5):897.

[17] TIAN B Y,CAO Y,ZHANG K Q.Metagenomic insights into communities,functions of endophytes,and their associates with infection by root-knot nematode,Meloidogyneincognita,in tomato roots [J].ScientificReports,2015,5:17087.

[18] EDWARDS J,JOHNSON C,SANTOS-MEDELLN C,etal.Structure,variation,and assembly of the root-associated microbiomes of rice [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2015,112(8):E911.

[19] MENDES L W,KURAMAE E E,NAVARRETE A A,etal.Taxonomical and functional microbial community selection in soybean rhizosphere [J].TheInternationalSocietyforMicrobialEcologyJournal,2014,8:1577.

[20] 李東萍,郭明璋,許文濤.16S rRNA測(cè)序技術(shù)在腸道微生物中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].生物技術(shù)通報(bào),2015,31(2):72.

LI D P,GUO M Z,XU W T.Advances and applications on methodology of 16S rRNA sequencing in gut microbiota analysis [J].Biotechnology,2015,31(2):72.

[21] YOON S H,HA S M,KWON S,etal.Introducing EzBioCloud:A taxonomically united database of 16S rRNA and whole genome assemblies [J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2017,67:1613.

[22] JEON Y S,LEE K,PARK S C,etal.EzEditor:A versatile sequence alignment editor for both rRNA- and protein-coding genes [J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2014,64:689.

[23] PEACE T A,BROCK K V,STILLS H F.Comparative analysis of the 16S rRNA gene sequence of the putative agent of proliferative ileitis of hamsters [J].InternationalJournalofSystematicBacteriology,1994,4:833.

[24] GOUY M,GUINDON S,GASCUEL O.SeaView version 4:A multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building [J].MolecularBiologyandEvolution,2010,27(2):221.

[25] WILL C,THRMER A,WOLLHERR A,etal.Horizon-specific bacterial community composition of German grassland soils,as revealed by pyrosequencing-based analysis of 16S rRNA genes [J].ApplliedEnvironmenntalMicrobiology,2010,76(20):6751.

[26] BERG G,SMALLA K.Plant species and soil type cooperatively shape the structure and function of microbial communities in the rhizosphere [J].FEMSMicrobiologyEcology,2009,68(1):1.

[27] JONES R T,ROBESON M S,LAUBER C L,etal.A comprehensive survey of soil acidobacterial diversity using pyrosequencing and clone library analyses [J].TheInternationalSocietyforMicrobialEcologyJournal,2009,3(4):442.

[28] BULGARELLI1 D,ROTT M,KLAUS-SCHLAEPPI K,etal.Revealing structure and assembly cues for Arabidopsis root-inhabiting bacterial microbiota [J].Nature,2012,488(7409):91.