向麗，王沛明，胡櫻凡，王平，孟憲麗

內(nèi)毒素血癥是由細菌內(nèi)毒素（LPS）進入血液后引發(fā)的一系列生理病理改變，嚴重時甚至危及生命。研究表明LPS進入機體后，經(jīng)過一系列的炎癥反應最終導致炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的大量釋放，這些炎癥因子的大量釋放又會進一步加重炎癥反應，造成機體的炎性損傷[1]。

大黃-黃芩作為方劑中的經(jīng)典藥對，兩者合用瀉火解毒，多用于熱毒證的治療。現(xiàn)代研究表明大黃、黃芩單味藥對炎癥和內(nèi)毒素血癥有良好的緩解和改善作用[2]，然而有關(guān)二者配伍使用的相關(guān)研究卻報道較少。本研究擬通過建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型，觀察大黃黃芩配伍后對LPS誘導的血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO影響，初步探討大黃-黃芩配伍后對內(nèi)毒素血癥大鼠的保護作用及作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠50只，體重200～240 g。由四川成都達碩科技有限公司所提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-24。飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學中醫(yī)臟腑病癥實驗室動物房（22±3℃，40% ～70%），SPF級，動物使用許可證號：SCXK（川）2012-179。

1.2 藥物與試劑

大黃與黃芩藥材購自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學藥學院嚴鑄云教授鑒定分別為藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi.的干燥根。LPS（美國Sigma公司，Ecoli O55:B5）； TNF-α ELISA 試劑盒（上海依科賽科技股份有限公司，批號141202）；IL-1β ELISA 試劑盒（上海依科賽科技股份有限公司，批號：141202）；IL-6 ELISA試劑盒（上海依科賽科技股份有限公司，批號：141128）；NO測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：141024）。

1.3 儀器

D-37520低溫高速離心機（ThermoFisher）；Varioskan 全波長多功能酶標儀（Thermo Fisher Scientific）。

2 方法

2.1 藥對水提物制備

大黃黃芩藥對配伍比例依據(jù)源于經(jīng)典方三黃瀉心湯中的大黃黃芩2:1的配比。準確稱取大黃30 g、黃芩15 g，加水約300 mL，浸泡0.5 h，用武火煎至沸騰后改用文火煎40 min。傾出藥液，加水約240 mL再煎25 min。合并藥液濃縮至100 mL，得0.45 g(生藥)/mL，置4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆? 于給藥前用蒸餾水以1∶0.5的倍比稀釋成0.45 g(生藥)/mL 和0.225 g(生藥)/mL。地塞米松片（陽性藥）用蒸餾水稀釋成0.75 mg﹒mL-1。

2.2 給藥、造模及取樣

雄性SD大鼠50只，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為5 組，每組10只，分別為空白組、模型組、地塞米松組、4.5和2.25 g﹒kg-1大黃-黃芩藥對組。各給藥組動物灌胃預防性給藥連續(xù)7 d，每日早晚各1次，空白組和模型組給予等體積的蒸餾水。末次給藥前禁食不禁水8 h，末次給藥結(jié)束后，除空白組外各組大鼠經(jīng)尾靜脈注射5 mg﹒kg-1LPS建立內(nèi)毒素血癥模型，空白組注射等體積的生理鹽水。大鼠注射LPS 6 h后，用20% 烏拉坦（1.0 g﹒kg-1體重）進行麻醉，股動脈取血，室溫放置半小時后，以3500 rpm離心15 min，分離上層血清并分裝保存于-80℃超低溫冰箱，待檢。

2.3 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量

采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟檢測大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

2.4 化學比色法檢測血清中NO的含量

采用化學比色法，嚴格按照測試盒說明書的操作步驟檢測大鼠血清中NO的含量。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以x±S表示，組間顯著性差異采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 大黃-黃芩藥對對內(nèi)毒素血癥模型大鼠血清中TNF-α的影響

由表1可知，與空白組比較，模型組大鼠血清中TNF-α的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，4.5 g﹒kg-1大黃-黃芩藥對組可顯著降低模型大鼠血清中TNF-α的水平（P＜0.05）。

表1 大黃黃芩藥對對內(nèi)毒素血癥模型大鼠TNF-α的影響(x±S，n=10)

3.2 大黃-黃芩藥對對內(nèi)毒素血癥模型大鼠血清中IL-1β的影響

由表2可知，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，4.5和2.25 g﹒kg-1大黃-黃芩藥對組可顯著降低模型大鼠血清中IL-1β的含量（P＜0.05）。

表2 大黃黃芩藥對對內(nèi)毒素血癥模型大鼠IL-1β的影響(x±S,n=10)

3.3 大黃-黃芩藥對對內(nèi)毒素血癥模型大鼠血清中IL-6的影響

由表3可知，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-6的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，4.5和2.25 g﹒kg-1大黃-黃芩藥對組可明顯降低模型大鼠血清中IL-6的水平（P＜0.05）。

表3 大黃黃芩藥對對內(nèi)毒素血癥模型大鼠IL-6的影響(x±S,n=10)

注：與模型組比較，* P＜0.05，**P＜0.01

3.4 大黃-黃芩藥對對內(nèi)毒素血癥模型大鼠血清中NO的影響

由表4可知，與空白組比較，模型組大鼠血清中NO的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，4.5和2.25 g﹒kg-1大黃-黃芩藥對組可明顯降低模型大鼠血清中NO的水平（P＜0.01或P＜0.05）。

表4 大黃黃芩藥對對內(nèi)毒素血癥模型大鼠NO的影響(x±S,n=10)

4 討論

內(nèi)毒素血癥是由LPS入侵機體后引起的一類綜合性疾病，嚴重時甚至危及生命[3]。LPS進入機體后，經(jīng)過一系列的炎癥反應最終導致炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的大量釋放，這些炎癥因子的大量釋放反過來又會進一步加重炎癥反應，造成機體的炎性損傷[4]。因此，通過抑制炎癥因子的釋放，是治療內(nèi)毒素血癥的有效途徑之一。

大黃-黃芩是方劑中的經(jīng)典藥對之一，兩者合用瀉火解毒，多用于的熱毒證的治療。研究發(fā)現(xiàn)大黃素可通過阻斷NF-κB炎癥通路，來減少炎癥因子的釋放達到緩解內(nèi)毒素血癥的作用[5～6]。大黃酸也可通過抑制IκBα降解和p65蛋白的轉(zhuǎn)位來減少炎癥因子的分泌[7]。黃芩苷可減少炎癥因子的釋放[8]。黃芩素亦可抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放[9]?，F(xiàn)代研究表明，中醫(yī)熱毒證證型與內(nèi)毒素血癥初期癥狀相似。因此大黃-黃芩藥對可用于內(nèi)毒素血癥初期的治療。

本次實驗結(jié)果表明大黃-黃芩藥對能不同程度地減少內(nèi)毒素血癥模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的釋放。研究表明過量表達的TNF-α可損傷內(nèi)皮細胞和組織，誘導其他炎癥細胞因子表達，進一步刺激炎癥反應[10]。IL-1β和IL-6是白細胞介素的重要成員，機體組織內(nèi)IL-1β和IL-6水平的過量升高能誘發(fā)多種炎性疾病[11～12]。NO是內(nèi)毒素血癥中的重要炎癥介質(zhì)，過量的NO也可促進炎癥反應的加劇以及多種炎癥因子的進一步釋放[13]。因此，抑制機體內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的產(chǎn)生對于炎性疾病的治療和控制具有重要的意義。大黃-黃芩藥對對TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的抑制作用表明其具有良好的保護炎癥的作用。提示大黃黃芩配伍使用改善內(nèi)毒素血證炎性損傷的作用機制可能是通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的水平來實現(xiàn)的。

綜上所述，大黃-黃芩配伍后對內(nèi)毒素血癥模型大鼠的炎性損傷有較好的保護作用，其作用機制可能是通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO釋放來實現(xiàn)的。

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