余佳麗，唐曉章，周菲，林美斯，林大勝，曹科

三七二醇皂苷 （Panaxadiolsaponins，PDS）是三七藥材經(jīng)乙醇提取、大孔吸附樹脂分離純化后得到的一類結(jié)構(gòu)類似的原人參二醇型皂苷，具有較強的藥理活性，其中人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd為其主要活性成分[1]，占PDS總組分的50% 以上。基于PDS在心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及抗腫瘤等方面體現(xiàn)出的良好的藥用價值[2-5]，課題組擬將其作為候選藥物，開發(fā)PDS新制劑。本實驗選取人參皂苷Rb1和Rd作為代表性成分，建立同時測定PDS中兩種主要藥效成分的含量測定方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察，為PDS含量測定和過程質(zhì)量控制提供方法。在此基礎(chǔ)上，對PDS在多種條件下的固有穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究，可為其進(jìn)一步的制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（配有vwd檢測器、自動進(jìn)樣器、四元梯度泵、在線脫氣裝置，美國Agilent公司），Agilent Chem Station色譜工作站（美國Agilent公司）；BT 125D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；SB25-12 DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；PCDXJB-10型實驗室專用超純水機（成都品成科技有限公司）；SHH-SDT綜合藥品穩(wěn)定性試驗箱（重慶市永生實驗儀器廠）。

1.2 試藥

人參皂苷Rb1，人參皂苷Rd對照品（批號分別為110704-201625，111818-201603；純度分別為93.7%，92.1%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純（美國Fisher公司），水為超純水，其它試劑均為分析純。PDS原料藥由成都泰合健康科技集團股份有限公司華神制藥廠生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法的建立

色譜柱：Waters Symetry Shield C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～15min，31%A；15～16min，31%→36%A；16～25min，36%A）；流速：1mL﹒min-1；檢測波長：203 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶液 31%的乙腈水溶液（初始流動相）。

2.2.2 混合對照品溶液 取人參皂苷Rb1對照品約15 mg，人參皂苷Rd對照品約2 mg，精密稱定，置于20 mL容量瓶中，用31%乙腈水溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取PDS原料粉末約0.15 g，精密稱定，置于具塞量瓶中，精密加入100 mL 31%乙腈水溶液后稱重，超聲（功率150w，頻率40kHz）處理15min，冷卻后補足損失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，臨用前用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性及專屬性 按照“2.2”方法分別制備得到空白溶液、混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，見圖1 。結(jié)果顯示，對照品連續(xù)進(jìn)樣5針，人參皂苷Rb1的峰面積的 RSD 為 0.51%，人參皂苷Rd的峰面積的RSD 為0.86%，對照品和供試品溶液中人參皂苷Rb1和Rd色譜峰的對稱因子在0.95～1.05之間，色譜峰與前后雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不小于6000，且空白溶液對主色譜峰無干擾，該色譜條件的系統(tǒng)適用性及專屬性良好。

圖1 三七二醇皂苷及其對照品HPLC圖

2.3.2 線性范圍 取人參皂苷Rb1和Rd對照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加入31% 乙腈水溶液溶解并定容，作為母液。分別精密量取適量上述母液，稀釋配制成人參皂苷Rb1濃度分別為0.1502、0.6008、0.7510、0.9012、1.5020 mg﹒mL-1的系列對照品溶液，人參皂苷Rd濃度分別為0.0202、0.0809、0.1011、0.1213、0.2022 mg﹒mL-1的系列對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度（X，mg﹒mL-1）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果表明，人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為：Y=2295.3X+8.0707，r=0.9993，線性范圍為0.1502～1.5020 mg﹒mL-1；人參皂苷Rd的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為：Y=2636.5X+11.733，r=0.9995，線性范圍為0.0202～0.2022 mg﹒mL-1。

2.3.3 精密度 取“2.2.2”項下制備的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算RSD，考察方法的精密度。結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果（n=6）

2.3.4 重復(fù)性 取PDS原料粉末約0.15 g，共6份，精密稱定，按照“2.2.3”項下方法制備得到6份供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜，分別計算人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的含量（%）。結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果（n=6）

2.3.5 加樣回收率 精密量取已知濃度的混合對照品溶液0.5、1、1.5 mL，分別置EP管中，氮氣吹干溶劑，每濃度下平行操作3份。精密量取已知濃度三七二醇皂苷供試品溶液1 mL，分別加入上述9個EP管中，渦旋、超聲使完全溶解后。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜，并計算加樣回收率。結(jié)果見表3、表4。

表3 人參皂苷Rb1加樣回收率試驗結(jié)果

表4 人參皂苷Rd加樣回收率試驗結(jié)果

5 0.0492 0.0558 0.1039 98.10%6 0.049 0.0558 0.1047 99.74%7 0.049 0.0837 0.1326 99.85%8 0.049 0.0837 0.1317 98.82%9 0.0492 0.0837 0.1332 100.39%

2.3.6 溶液穩(wěn)定性 取“2.2.2”和“2.2.3”項下混合對照品和供試品溶液各適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜。結(jié)果對照品溶液中人參皂苷Rb1和Rd峰面積的RSD值分別為0.32%和0.62%，供試品溶液中人參皂苷Rb1和Rd峰面積的RSD值分別為0.41%和1.22%，提示對照品和供試品在溶劑中24h內(nèi)均具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.7 耐用性 通過單變量分析法微調(diào)測試條件中的單個變量觀察結(jié)果的不同影響程度，改變的測試變量為色譜條件變量（流速、柱溫和色譜柱）[6]，記錄色譜，分別計算人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的含量。結(jié)果見表5。

表5 耐用性試驗結(jié)果

2.4 固有穩(wěn)定性研究

2.4.1 不同pH值溶液對PDS主要藥效成分的影響 取PDS 原料藥約0.15 g，共5份，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，分別加入蒸餾水、pH 7.4、pH 6.8、pH 4.5及pH 1.2的緩沖溶液使溶解，并定容至刻度，于室溫下放置，分別于第0、2、4、8、12、24 h取樣，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜，并以0 h時各皂苷的含量為100%，分別計算不同時間點各皂苷的含量變化情況。結(jié)果見表6。

表6 不同pH值溶液中PDS主要成分穩(wěn)定性實驗結(jié)果

8 22.32 101.23 99.65 100.14 100.78 31.96 100.24 99.73 99.41 101.0912 10.18 100.47 101.21 100.34 99.65 17.53 98.82 100.44 100.69 100.7824 4.29 99.34 100.72 101.25 99.3 6.98 100.71 99.65 100.7 99.24

2.4.2 高溫試驗 取適量PDS原料藥置稱量瓶中，攤成厚度≤5 mm的薄層，在60℃ 綜合藥品穩(wěn)定性試驗箱中放置10d，于5，10d取樣，考察樣品含量的變化。結(jié)果見表7。

表7 高溫試驗結(jié)果

2.4.3 高濕試驗 取適量PDS原料藥置稱量瓶中，攤成≤5 mm厚的薄層，在25℃ 相對濕度（75±5）%的綜合藥品穩(wěn)定性試驗箱中放置10 d，于5，10 d取樣，考察樣品的重量和含量的變化。結(jié)果見表8。

表8 高濕試驗結(jié)果

2.4.4 強光試驗 取適量PDS原料藥置稱量瓶中，攤成≤5 mm 厚的薄層，置于綜合藥品穩(wěn)定性試驗箱內(nèi)，在照度為（4500±500）lx的條件下放置10 d，于5，10 d取樣，考察樣品的外觀和含量的變化。結(jié)果見表9。

表9 強光試驗結(jié)果

3 討論

3.1 PDS主要藥效成分含量測定方法的建立

本實驗選取人參皂苷Rb1和Rd作為代表性成分，通過調(diào)整流動相比例，在保證目標(biāo)成分分離完全的情況下，建立同時測定PDS中兩種主要藥效成分的含量測定方法，與三七藥材含量測定方法比較，顯著縮短了檢測時間。該方法操作簡單，重復(fù)性、準(zhǔn)確度及耐用性等均良好，為PDS主要藥效成分的含量測定和過程質(zhì)量控制提供了科學(xué)合理的方法。

3.2 PDS固有穩(wěn)定性的研究

藥物固有穩(wěn)定性研究作為處方前研究的重點內(nèi)容[7]，可以有效指導(dǎo)制劑開發(fā)過程中輔料與劑型的選擇、處方設(shè)計及工藝優(yōu)化等。但在傳統(tǒng)中藥制劑的研究中，鮮有針對制劑流程中某成分的含量變化或穩(wěn)定性的關(guān)注。本實驗通過對不同pH值溶液對PDS主要藥效成分影響的考察，發(fā)現(xiàn)PDS在強酸溶液中極不穩(wěn)定。因此，在制劑制備過程中應(yīng)該避免使用強酸性溶媒，而在給藥途徑選擇時，應(yīng)考慮胃酸環(huán)境對PDS的影響。影響因素試驗結(jié)果表明，高溫、高濕和強光對PDS穩(wěn)定性均有一定程度的影響，提示PDS應(yīng)在常溫、干燥、避光條件下制備與保存，作為口服劑型的原料藥或應(yīng)慎重選擇輔料以保證其穩(wěn)定性。

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