馬慶偉，周鳳麗，戰(zhàn)曉微，王莉莉，劉昕超，曲芬，曹峰林

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix－assisted Laser Desorption－ionization Time－of－flight Mass Spectrometry，MS）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的鑒定病原微生物的新技術(shù)，可通過(guò)對(duì)供試病原微生物蛋白指紋圖譜進(jìn)行同源分析而快速鑒定菌種，對(duì)疾病診斷具有重要意義［1-4］。與傳統(tǒng)病原微生物鑒定方法相比，MS技術(shù)具有靈敏度較高、準(zhǔn)確率較高、耗能較低、高通量等優(yōu)點(diǎn)。目前，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室使用的MS系統(tǒng)多為德國(guó)布魯克基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Bruker Microflex MS）系統(tǒng)和法國(guó)梅里埃公司的Vitek質(zhì)譜系統(tǒng)，但進(jìn)口質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，一次性投入成本較高。國(guó)產(chǎn)Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)及其配套的飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑（Clin－TOF試劑）在價(jià)格和臨床鑒定準(zhǔn)確率方面均具有優(yōu)勢(shì)。本研究旨在比較Clin－TOF試劑與Bruker樣本處理基質(zhì)液（Bruker基質(zhì)液）預(yù)處理對(duì)病原菌鑒定效能的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 選取2017年1—5月中國(guó)人民解放軍第302醫(yī)院臨床常規(guī)分離的菌株103株，其中革蘭陰性菌36株、革蘭陽(yáng)性菌33株、真菌34株，均置于－80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.2 試劑與儀器 Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)及其配套Clin－TOF試劑購(gòu)自北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司，Bruker Microflex MS系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)布魯克?道爾頓公司，Bruker基質(zhì)液根據(jù)Bruker配方配制。

1.3 方法

1.3.1 菌株傳代 將常規(guī)分離的103株菌株置于固體培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線，用接種環(huán)挑取單菌落。

1.3.2 儀器校正 檢測(cè)前使用大腸桿菌ATCC8739單菌落（購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行儀器校正，嚴(yán)格按照儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3 Clin－TOF試劑預(yù)處理供試菌株 每個(gè)離心管（200 μl）中加入30 μl組分Ⅰ，采用無(wú)菌接種環(huán)或槍頭挑取單菌落放于離心管中，震蕩混勻5 min，加1 μl樣品到靶板上，自然干燥后加1 μl組分Ⅱ，覆蓋在樣品點(diǎn)上，自然干燥后分別使用Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)和Bruker Microflex MS系統(tǒng)采集圖譜并進(jìn)行鑒定，每個(gè)菌株平行檢測(cè)3次。

1.3.4 Bruker基質(zhì)液預(yù)處理供試菌株 無(wú)菌牙簽挑取樣品單菌落均勻抹在Macro 96孔靶板上，自然干燥后在樣品點(diǎn)上覆蓋1 μl Bruker基質(zhì)液，自然干燥后分別使用Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)和Bruker Microflex MS系統(tǒng)采集圖譜并進(jìn)行鑒定，每個(gè)菌株平行檢測(cè)3次。

1.4 結(jié)果判定 Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)：置信度≥25.0分為鑒定結(jié)果可信；置信度為20.0～24.9分需通過(guò)其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，選出最終鑒定結(jié)果；置信度＜20.0分為鑒定結(jié)果不可靠，建議重新處理菌株或重新采集樣品點(diǎn)測(cè)試。Bruker Microflex MS系統(tǒng)鑒定分值2.300～3.000為鑒定在種水平完全可靠；分值2.000～2.299為鑒定在屬水平可信；分值1.700～1.999為鑒定在屬水平有可能。所有菌株經(jīng)16S rRNA擴(kuò)增測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株情況 革蘭陰性菌36株，其中產(chǎn)酸克雷伯菌5株、肺炎克雷伯菌3株、摩氏摩根菌3株、黏質(zhì)沙雷菌3株、陰溝腸桿菌3株、鮑曼不動(dòng)桿菌2株、銅綠假單胞菌2株、液化沙雷菌2株、嗜麥芽窄食單胞菌2株、副溶血弧菌2株、流感嗜血桿菌2株、皮特不動(dòng)桿菌1株、弗勞地檸檬酸桿菌1株、大腸埃希菌1株、產(chǎn)氣腸桿菌1株、奇異變形菌1株、施氏假單胞菌1株、腐敗希瓦菌1株。革蘭陽(yáng)性菌33株，其中紋帶棒桿菌2株、鳥(niǎo)腸球菌1株、鉛黃腸球菌1株、小腸腸球菌1株、糞腸球菌2株、屎腸球菌1株、單核增生李斯特菌2株、藤黃微球菌2株、空間羅菌1株、無(wú)乳鏈球菌2株、表皮葡萄球菌2株、溶血葡萄球菌2株、人葡萄球菌1株、金黃色葡萄球菌2株、停乳鏈球菌2株、路鄧葡萄球菌2株、腐生葡萄球菌1株、沃氏葡萄球菌2株、解沒(méi)食子酸鏈球菌1株、口腔鏈球菌2株、唾液鏈球菌1株。真菌34株，其中白色假絲酵母菌2株、鏈狀假絲酵母菌3株、光滑假絲酵母菌2株、希木龍假絲酵母菌3株、平常假絲酵母菌3株、葡萄牙假絲酵母菌3株、Candida nivariensis 3株、近平滑假絲酵母菌3株、熱帶假絲酵母菌1株、羅倫隱球菌3株、新型隱球菌1株、東方伊薩酵母1株、奧默柯達(dá)菌1株、異常畢赤酵母1株、費(fèi)比恩畢赤酵母1株、季也蒙畢赤酵母1株、膠紅酵母菌1株、阿薩希絲孢酵母菌1株。

2.2 質(zhì)譜圖 在Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)上，采用Clin－TOF試劑預(yù)處理供試菌株后所得質(zhì)譜圖基線平滑，特征信號(hào)較多，信噪比較高，重現(xiàn)性較好；對(duì)較難鑒定的新型隱球菌也能檢測(cè)出特征信號(hào)。使用Bruker基質(zhì)液預(yù)處理供試菌株后，所得質(zhì)譜圖特征信號(hào)較少，信噪比較低，多次點(diǎn)樣后質(zhì)譜圖重現(xiàn)性較差，見(jiàn)圖1。

但哥們兒朝洛蒙想錯(cuò)了。搬家那天就被冰箱砸著了腳趾頭，腫得像個(gè)白蘿卜。到診所點(diǎn)了藥水，纏了些繃帶，耽誤了半天工，上班時(shí)一只腳上還穿著塑料拖鞋，走路一瘸一拐的像裝著假肢。

2.3 菌株鑒定結(jié)果 在Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)上，Clin－TOF試劑預(yù)處理和Bruker基質(zhì)液預(yù)處理后革蘭陰性菌單次鑒定準(zhǔn)確率、3次平行鑒定準(zhǔn)確率及真菌3次平行鑒定準(zhǔn)確率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Clin－TOF試劑預(yù)處理后革蘭陽(yáng)性菌單次鑒定準(zhǔn)確率、3次平行鑒定準(zhǔn)確率及真菌單次鑒定準(zhǔn)確率高于Bruker基質(zhì)液預(yù)處理，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。在Bruker Microflex MS系統(tǒng)上，Clin－TOF試劑預(yù)處理和Bruker基質(zhì)液預(yù)處理后革蘭陰性菌單次鑒定準(zhǔn)確率、3次平行鑒定準(zhǔn)確率，革蘭陽(yáng)性菌單次鑒定準(zhǔn)確率、3次平行鑒定準(zhǔn)確率，真菌單次鑒定準(zhǔn)確率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Clin－TOF試劑預(yù)處理后真菌3次平行鑒定準(zhǔn)確率高于Bruker基質(zhì)液預(yù)處理，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

3 討論

質(zhì)譜圖的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性是微生物獲得準(zhǔn)確鑒定結(jié)果的重要影響因素。微生物蛋白指紋圖譜的峰型分布受多種因素影響，如培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、處理方法、基質(zhì)配方等［5-6］。既往研究結(jié)果顯示，不同基質(zhì)配方會(huì)影響質(zhì)譜儀出峰情況［7］，分析其原因可能與細(xì)菌和真菌細(xì)胞壁的主要成分及不同菌種細(xì)胞壁厚度不同有關(guān)。細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分為肽聚糖，革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁厚度為20～80 nm，革蘭陰性菌的細(xì)胞壁厚度為10～15 nm；真菌細(xì)胞壁的主要成分為幾丁質(zhì)和葡聚糖，厚度為100～250 nm［8］。因此，選擇合適的基質(zhì)配方是成功使用MS技術(shù)的關(guān)鍵。基質(zhì)的主要作用是吸收能量傳遞給樣品分子，并保護(hù)樣品分子不被強(qiáng)烈的激光破壞，減弱樣品分子間的相互作用。目前，MS常用的基質(zhì)配方包括α－氰基－4－羥基肉桂酸（CHCA）、2，5－二羥基苯甲酸（DHB）、蒽三酚（DI）、阿魏酸（FA）、3－吲哚丙烯酸（IAA）、維A酸（RA）、2，4，6－ 三羥基苯乙酮（THAP）等［9］。Clin－TOF試劑是根據(jù)細(xì)菌和真菌細(xì)胞壁的特點(diǎn)對(duì)預(yù)處理基質(zhì)配方進(jìn)行優(yōu)化，利于細(xì)胞破壁，降低了人為配置預(yù)處理試劑導(dǎo)致的誤差，提高了質(zhì)譜圖的穩(wěn)定性及微生物鑒定準(zhǔn)確率。本研究使用的Clin－TOF試劑包括組分Ⅰ和組分Ⅱ，經(jīng)Clin－TOF試劑預(yù)處理后微生物蛋白指紋圖譜特征峰更多，基線平滑，信噪比較高，有助于獲得更穩(wěn)定的鑒定結(jié)果。

圖1 Clin－TOF試劑和Bruker基質(zhì)液預(yù)處理供試菌株后Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)質(zhì)譜圖Figure 1 Mass spectrogram of Clin－TOF－Ⅱ type MS after pre－processing of Clin－TOF Reagent and Bruker Matrix

表1 不同預(yù)處理試劑預(yù)處理供試菌株后Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)鑒定結(jié)果比較（±s，%）Table 1 Comparison of identification results on Clin－TOF－ Ⅱ type MS between pre－processing of Clin－TOF Reagent and pre－processing of Bruker Matrix

表1 不同預(yù)處理試劑預(yù)處理供試菌株后Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)鑒定結(jié)果比較（±s，%）Table 1 Comparison of identification results on Clin－TOF－ Ⅱ type MS between pre－processing of Clin－TOF Reagent and pre－processing of Bruker Matrix

預(yù)處理試劑　　革蘭陰性菌　　革蘭陽(yáng)性菌　　真菌單次鑒定準(zhǔn)確率　3次平行鑒定準(zhǔn)確率　　單次鑒定準(zhǔn)確率　3次平行鑒定準(zhǔn)確率　　單次鑒定準(zhǔn)確率　3次平行鑒定準(zhǔn)確率Clin－TOF 試劑　100.00±0.00　92.59±3.00　100.00±0.00　97.98±2.02　100.00±0.00　98.04±1.96 Bruker基質(zhì)液　100.00±0.00　96.30±2.21　87.88±5.31　82.83±5.55　64.71±8.32　58.82±8.09 t值　0.000　?。?.021　2.101　2.392　4.243　4.710 P值　1.000　0.311　0.044　0.022　?。?.001　3.468

表2 不同預(yù)處理試劑處理供試菌株后Bruker Microflex MS系統(tǒng)鑒定結(jié)果比較（±s，%）Table 2 Comparison of identification results on Bruker Microflex MS between pre－processing of Clin－TOF Reagent and pre－processing of Bruker Matrix

表2 不同預(yù)處理試劑處理供試菌株后Bruker Microflex MS系統(tǒng)鑒定結(jié)果比較（±s，%）Table 2 Comparison of identification results on Bruker Microflex MS between pre－processing of Clin－TOF Reagent and pre－processing of Bruker Matrix

預(yù)處理試劑　　革蘭陰性菌　　革蘭陽(yáng)性菌　　真菌單次鑒定準(zhǔn)確率　3次平行鑒定準(zhǔn)確率　　單次鑒定準(zhǔn)確率　3次平行鑒定準(zhǔn)確率　　單次鑒定準(zhǔn)確率 3次平行鑒定準(zhǔn)確率Clin－TOF 試劑　100.00±0.00　92.59±2.69　100.00±0.00　97.98±2.02　85.29±6.16　83.33±6.33 Bruker基質(zhì)液　100.00±0.00　94.44±2.48　93.94±4.35　91.92±4.36　70.59±7.93　60.78±7.89 t值　0.000　?。?.505　1.437　1.261　1.464　2.228 P值　1.000　0.615　0.160　0.214　0.148　0.029

本研究比較了Clin－TOF試劑與Bruker基質(zhì)預(yù)處理對(duì)病原菌鑒定效能的影響，結(jié)果顯示，在Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)上，Clin－TOF試劑預(yù)處理后革蘭陽(yáng)性菌單次鑒定準(zhǔn)確率、3次平行鑒定準(zhǔn)確率及真菌單次鑒定準(zhǔn)確率高于Bruker基質(zhì)液預(yù)處理；在Bruker Microflex MS系統(tǒng)上，Clin－TOF試劑預(yù)處理后真菌3次平行鑒定準(zhǔn)確率高于Bruker基質(zhì)液預(yù)處理；提示與Bruker基質(zhì)液相比，采用Clin－TOF試劑預(yù)處理供試菌株后Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)對(duì)革蘭陽(yáng)性菌及真菌鑒定準(zhǔn)確率較高，Bruker Microflex MS系統(tǒng)對(duì)真菌鑒定準(zhǔn)確率較高，分析其原因可能與Clin－TOF試劑有助于菌體蛋白成分釋放有關(guān)。

綜上所述，與Bruker基質(zhì)液相比，采用Clin－TOF試劑預(yù)處理供試菌株后Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)對(duì)革蘭陽(yáng)性菌及真菌鑒定準(zhǔn)確率較高，Bruker Microflex MS系統(tǒng)對(duì)真菌鑒定準(zhǔn)確率較高。此外，采用Clin－TOF－Ⅱ型MS系統(tǒng)及其配套Clin－TOF試劑具有準(zhǔn)確、靈敏、快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)，解決了臨床微生物鑒定工作成本高、周期長(zhǎng)、重復(fù)性差等問(wèn)題，對(duì)微生物鑒定工作具有重要意義。