薛清，李寧，褚恒，劉曉紅，韓林，徐志云

主動(dòng)脈瓣鈣化是臨床常見(jiàn)的心臟瓣膜疾病，也是導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣狹窄的常見(jiàn)原因，其發(fā)生機(jī)制目前尚未完全明確，主要治療措施為外科手術(shù)［1］。主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（AVICs）是構(gòu)成主動(dòng)脈瓣的主要細(xì)胞之一，對(duì)維持瓣膜正常形態(tài)和功能、促進(jìn)瓣膜疾病發(fā)生發(fā)展均具有重要作用，被認(rèn)為是主動(dòng)脈瓣異位鈣化中成骨細(xì)胞的主要來(lái)源［2］。有機(jī)磷酸鹽（OP）－鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基（OIM）誘導(dǎo)AVICs鈣化約需要21 d，周期較長(zhǎng)，且誘導(dǎo)鈣化過(guò)程易受微生物污染等因素干擾［3］，而OP轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷酸鹽（IP）后才能發(fā)揮誘導(dǎo)鈣化作用［4-5］。本研究旨在比較OP－OIM與IP－OIM誘導(dǎo)AVICs鈣化的效果，為快速構(gòu)建體外AVICs鈣化模型提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 主動(dòng)脈瓣膜來(lái)源于2017年1—10月在第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院行心臟移植的患者，取外觀(guān)正常的主動(dòng)脈瓣膜備用。本研究獲得第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及其家屬均簽署知情同意書(shū)。排除術(shù)前伴主動(dòng)脈瓣膜疾病、冠心病者。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 人Ⅱ型膠原酶、β－甘油磷酸、抗壞血酸、地塞米松購(gòu)自Sigma－Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗液、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；鼠抗人Vimentin抗體、Alexa Flour594標(biāo)記的羊抗鼠IgG、鼠抗人CD31抗體、Alexa Flour568標(biāo)記的羊抗鼠IgG、鼠抗人β－actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；二水合磷酸二氫鈉、三氯甲烷、異丙醇、甲醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生物合成人胰島素注射液購(gòu)自丹麥諾和諾德公司；Trizol裂解液、SDS蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、SDS－PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）、SDS－PAGE凝膠配制試劑盒、Western封閉液、Western一抗稀釋液、兔抗人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNΧ2）抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Beyotime公司；DEPC處理水購(gòu)自Solarbio公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購(gòu)自TaKaRa公司；三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸購(gòu)自廣東金砂化工廠(chǎng)；茜素紅購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；鈣測(cè)定試劑盒（鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法）購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。

本研究背景：

經(jīng)典的有機(jī)磷酸鹽－鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基完成1次細(xì)胞鈣化約需21 d，周期較長(zhǎng)，且在培養(yǎng)過(guò)程中易受到各種因素干擾，如微生物污染等。筆者所在課題組通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷酸鹽是在轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷酸鹽后才發(fā)揮誘導(dǎo)鈣化作用，故提出是否可以直接采用無(wú)機(jī)磷酸鹽－鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞鈣化的假設(shè)，以尋找一種快速有效的鈣化誘導(dǎo)方法，為今后基礎(chǔ)研究提供便利條件。

1.2.2 主要儀器 MP200B電子天平購(gòu)自上海第二天平衡器廠(chǎng)；IX70激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；流式細(xì)胞儀、NanoDrop2000分光光度計(jì)購(gòu)自ThermoFisher公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；GeneAmp聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀、ABI Step One實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自普林斯頓公司；蛋白電泳儀、電泳槽、SX－100凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自Bio－Rad公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 AVICs分離和培養(yǎng) 采用改良的二次膠原酶消化法分離AVICs，具體如下：取正常主動(dòng)脈瓣膜組織經(jīng)人Ⅱ型膠原酶消化處理兩次后去除組織殘?jiān)?，剩余液體1 500 r/min離心5 min（離心半徑168 mm），去上清，底部沉淀即為AVICs。將細(xì)胞重懸后接種于培養(yǎng)板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，至細(xì)胞融合度達(dá)到90%～100%傳代，取第3～5代細(xì)胞備用。

1.3.2 AVICs鑒定 （1）采用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)Vimentin，具體如下：AVICs貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到40%～50%時(shí)去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）潤(rùn)洗1次；加入免疫染色固定液室溫下靜置15 min，去除固定液，PBS潤(rùn)洗3次；加入0.3% Triton X－100室溫下靜置10 min，去除破膜液，PBS潤(rùn)洗3次；加入免疫染色封閉液室溫下靜置10 min，去除封閉液，加入一抗工作液（鼠抗人Vimentin抗體:免疫染色一抗稀釋液為1:200）4 ℃過(guò)夜，室溫下復(fù)溫1 h，PBS潤(rùn)洗3次；加入二抗工作液（Alexa Flour594標(biāo)記的羊抗鼠IgG:PBS為1:400）室溫下避光靜置30 min，PBS潤(rùn)洗3次；加入DAPI熒光染色液室溫下避光靜置3 min，PBS潤(rùn)洗3次；熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照，其中紅色熒光為Vimentin、藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。（2）采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD31，具體如下：AVICs貼壁生長(zhǎng)2～3 d，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%～100%時(shí)去除培養(yǎng)基，PBS潤(rùn)洗1次；加入0.25%胰蛋白酶室溫下靜置5 min，加入等體積普通培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基）中和胰蛋白酶，1 200 r/min 離心5 min（離心半徑168 mm），去除上清液；加入PBS重懸細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min（離心半徑168 mm），去除上清液；加入一抗工作液（鼠抗人CD31抗體:免疫染色一抗稀釋液為1:200）室溫下靜置1 h，1 200 r/min 離心5 min（離心半徑168 mm），去除上清液；加入PBS重懸細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min（離心半徑168 mm），去除上清液；加入二抗工作液（Alexa Flour568標(biāo)記的羊抗鼠IgG:PBS為1:400）室溫下避光靜置30 min，1 200 r/min離心5 min（離心半徑168 mm），去除上清液；加入PBS重懸細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min（離心半徑168 mm），去除上清液；加入PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 將備用AVICs于6孔板中貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到40%～50%時(shí)隨機(jī)分為A組與B組。A組采用普通培養(yǎng)基+OP－OIM進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d換液1次；B組采用普通培養(yǎng)基+IP－OIM進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d換液1次。OP－OIM：β－甘油磷酸10 mmol/L、抗壞血酸10 μg/ml、地塞米松10 nmol/L；IP－OIM：二水合磷酸二氫鈉2 mmol/L、抗壞血酸50 μg/ml、生物合成人胰島素注射液100 nmol/L。

1.3.4 茜素紅染色 采用茜素紅染色觀(guān)察鈣化結(jié)節(jié)，具體如下：去除AVICs培養(yǎng)基，采用4%多聚甲醛固定10 min，95%乙醇沖洗后采用1%茜素紅染色10 min，去除染色液，采用95%乙醇沖洗后于顯微鏡下觀(guān)察并拍照，其中橘紅色結(jié)節(jié)為鈣化結(jié)節(jié)，以出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)為AVICs鈣化模型構(gòu)建成功。

1.3.5 鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法 采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法檢測(cè)A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d、B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d鈣含量，具體如下：去除AVICs培養(yǎng)基，PBS潤(rùn)洗后加入0.6 mol/L鹽酸脫鈣24 h，取上清液，采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法檢測(cè)鈣濃度；脫鈣后的細(xì)胞經(jīng)PBS潤(rùn)洗3次，加入0.1 mol/L氫氧化鈉（NaOH）和0.1% SDS蛋白裂解液裂解細(xì)胞30 min，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，并計(jì)算鈣含量，鈣含量=鈣濃度/蛋白濃度。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)A組細(xì)胞培養(yǎng)0、21 d及B組細(xì)胞培養(yǎng)0、7 d RUNΧ2、堿性磷酸酶（ALP）mRNA表達(dá)情況，具體如下：采用Trizol裂解液抽提總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），并以cDNA為模板行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列詳見(jiàn)表1。反應(yīng)步驟：pre－incubation：95 ℃（30 s），1個(gè)循環(huán)；amplification：95 ℃（10 s），60 ℃（20 s），40個(gè)循環(huán)；Melting Curve：95 ℃（15 s），60 ℃（60 s），95 ℃（60 s），1個(gè)循環(huán)；Cooling：40 ℃（60 s）1個(gè)循環(huán)。以β－actin作為內(nèi)參，采用ΔΔCT法計(jì)算各樣本間目的基因mRNA表達(dá)的倍比關(guān)系即為各樣本目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence for RT－qPCR

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)A組細(xì)胞培養(yǎng)0、21 d及B組細(xì)胞培養(yǎng)0、7 d RUNΧ2蛋白表達(dá)情況，具體如下：抽提總蛋白，經(jīng)超聲破碎儀輔助裂解，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，并于沸水中煮10～15 min制成蛋白樣本；配制SDS－PAGE分離膠、濃縮膠、電泳緩沖液，每組蛋白樣本取20 μl進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后根據(jù)目的蛋白分子量裁剪目的條帶和內(nèi)參條帶，Western封閉液封閉1 h，將目的條帶和內(nèi)參條帶分別浸沒(méi)在由Western一抗稀釋液、目的蛋白抗體或內(nèi)參蛋白抗體配制成的一抗工作液中，4 ℃搖床搖晃過(guò)夜；室溫下復(fù)溫1 h，TBST清洗3次，10 min/次；配制二抗工作液并浸沒(méi)目的條帶和內(nèi)參條帶，搖床搖晃1 h，TBST清洗3次，10 min/次；將目的條帶和內(nèi)參條帶分別置于SX－100凝膠成像儀中，滴加化學(xué)發(fā)光工作液并拍照；采用Image J軟件進(jìn)行圖像處理，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.8 對(duì)硝基苯酚比色法 采用對(duì)硝基苯酚比色法檢測(cè)A組細(xì)胞培養(yǎng)0、21 d及B組細(xì)胞培養(yǎng)0、7 d ALP活性，具體如下：去除AVICs培養(yǎng)基，加入1 ml GENMED清理液覆蓋細(xì)胞表面，小心吸除清理液，使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞；再次加入1 ml GENMED清理液，混勻后移至預(yù)冷的1.5 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min（離心半徑168 mm），去除上清液；加入200 μl GENMED裂解液，混勻后移至新的預(yù)冷的1.5 ml離心管中，震蕩15 s，冰上孵育30 min，13 000 r/min離心5 min（離心半徑47 mm）；移取500 μl上清液至新的預(yù)冷的1.5 ml離心管中，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度；96孔板依次加入220 μl GENMED緩沖液、25 μl GENMED反應(yīng)液，37 ℃孵育3 min，分別加入5 μl GENMED清理液或待測(cè)樣本，放入酶標(biāo)儀中檢測(cè)405 nm波長(zhǎng)時(shí)0、5 min讀數(shù)，并計(jì)算ALP活性，ALP活性=〔（待測(cè)樣本讀數(shù)－對(duì)照樣本讀數(shù)）×樣本稀釋倍數(shù)×0.25〕×（0.005×18.5×0.6×5）-1×待測(cè)樣本蛋白濃度-1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AVICs鑒定結(jié)果 Vimentin是間葉源性細(xì)胞標(biāo)志物，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，分離得到的細(xì)胞Vimentin陽(yáng)性率接近100%，見(jiàn)圖1。CD31是內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，分離得到的細(xì)胞CD31陽(yáng)性率為1.17%，見(jiàn)圖2。

2.2 鈣化結(jié)節(jié)和鈣含量 A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d可見(jiàn)大量橘紅色鈣化結(jié)節(jié)，B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d可見(jiàn)大量橘紅色鈣化結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖3。A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d鈣含量為（0.107±0.007）mg/mg蛋白，B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d鈣含量為（0.105±0.011）mg/mg蛋白。A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d和B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d鈣含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.266，P=0.804）。

2.3 RUNΧ2和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量 以細(xì)胞培養(yǎng)0 d作為對(duì)照，A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d RUNΧ2 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.568±0.302），ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.345±0.118）；B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d RUNΧ2 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.907±0.214），ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量為（2.171±0.178）。A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d與B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d RUNΧ2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.586，P=0.188）；但A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d與B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.699，P=0.003）。

圖1 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果（DAPI復(fù)染，×200）Figure 1 Cell immunofluorescence detection results

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果Figure 2 Flow cytometry test results

2.4 RUNΧ2蛋白相對(duì)表達(dá)量 A組細(xì)胞培養(yǎng)0 d RUNΧ2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.218±0.015），培養(yǎng)21 d為（1.031±0.024）；B組細(xì)胞培養(yǎng)0 d RUNΧ2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.197±0.014），培養(yǎng)7 d為（0.991±0.032）。兩組細(xì)胞培養(yǎng)0 d RUNΧ2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.773，P=0.151）；A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d與B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d RUNΧ2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.732，P=0.158）。

圖3 兩組細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)鈣化結(jié)節(jié)（茜素紅染色，×100）Figure 3 Calcified nodes in the two groups at different time points of cultivation

2.5 ALP活性 A組細(xì)胞培養(yǎng)0 d ALP活性為（0.011±0.002）U/mg蛋白，培養(yǎng)21 d為（0.185±0.019）U/mg蛋白；B組細(xì)胞培養(yǎng)0 d ALP活性為（0.012±0.003）U/mg蛋白，培養(yǎng)7 d為（0.196±0.024）U/mg蛋白。兩組細(xì)胞培養(yǎng)0 d ALP活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.480，P=0.656）；A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d與B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d ALP活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.732，P=0.158）。

3 討論

主動(dòng)脈瓣鈣化類(lèi)似于成骨，是一個(gè)主動(dòng)的可逆的病理過(guò)程［6］，涉及瓣膜間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、新生血管形成、血流機(jī)械應(yīng)力改變、脂質(zhì)浸潤(rùn)、鈣磷代謝紊亂、炎性刺激等［7-8］。主動(dòng)脈瓣鈣化可引起主動(dòng)脈瓣狹窄、關(guān)閉不全等，已成為臨床研究熱點(diǎn)。AVICs是構(gòu)成主動(dòng)脈瓣膜的主要細(xì)胞之一，也是主動(dòng)脈瓣異位鈣化中成骨細(xì)胞的主要來(lái)源。因此獲取優(yōu)質(zhì)的AVICs是建立體外鈣化模型的前體條件，本研究采用改良的二次膠原酶消化法分離AVICs，結(jié)果顯示，分離得到的細(xì)胞Vimentin陽(yáng)性率接近100%，CD31陽(yáng)性率為1.17%，提示采用改良的二次膠原酶消化法分離得到的AVICs純度較高，符合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)要求。

OIM是建立體外AVICs鈣化模型的關(guān)鍵，目前常用的OP－OIM主要由β－甘油磷酸、抗壞血酸、地塞米松組成［9］，其中β－甘油磷酸被認(rèn)為是最重要的鈣化誘導(dǎo)因素之一，其經(jīng)ALP分解后可產(chǎn)生IP，進(jìn)而誘導(dǎo)鈣化［10］；抗壞血酸能促進(jìn)軟骨細(xì)胞成熟，提高軟骨細(xì)胞中ALP含量，進(jìn)而加速鈣化［11］。但OP－OIM誘導(dǎo)AVICs鈣化周期較長(zhǎng)，約為21 d，且誘導(dǎo)鈣化過(guò)程易受到多種因素干擾而導(dǎo)致建模失?。?2］。因此，尋找一種培養(yǎng)周期較短、易操作的OIM具有重要的研究?jī)r(jià)值。李寰等［13］研究結(jié)果顯示，β－甘油磷酸誘導(dǎo)細(xì)胞鈣化無(wú)濃度依賴(lài)性，12 mmol/L時(shí)效果最佳；＞100 nmol/L地塞米松對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖均具有抑制作用，而100 nmol/L地塞米松有利于細(xì)胞成骨化［14］。近年研究結(jié)果顯示，堿性環(huán)境、炎性因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2等均可與β－甘油磷酸協(xié)同誘導(dǎo)鈣化，但其對(duì)縮短鈣化時(shí)間均無(wú)明顯作用［15-18］。鑒于OP是轉(zhuǎn)化為IP后才發(fā)揮鈣化誘導(dǎo)作用，本研究分別采用OP－OIM與IP－OIM培養(yǎng)AVICs，并比較兩種OIM對(duì)AVICs鈣化的影響。

本研究結(jié)果顯示，A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d、B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d可見(jiàn)大量橘紅色鈣化結(jié)節(jié)，提示A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d時(shí)成功建立AVICs鈣化模型，B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d時(shí)成功建立AVICs鈣化模型。鈣含量可直觀(guān)地反映鈣化程度，RUNΧ2和ALP是AVICs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志物，亦可有效評(píng)估鈣化程度。本研究結(jié)果顯示，A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d與B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d 鈣含量間無(wú)差異，A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d與B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d RUNΧ2 mRNA相對(duì)表達(dá)量、RUNΧ2蛋白相對(duì)表達(dá)量、ALP活性間均無(wú)差異，但A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d與B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d與B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d AVICs鈣化效果相當(dāng)；雖然A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d與B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但A組細(xì)胞培養(yǎng)21 d與B組細(xì)胞培養(yǎng)7 d ALP活性間無(wú)差異，故對(duì)評(píng)價(jià)鈣化效果無(wú)影響。

綜上所述，IP－OIM培養(yǎng)7 d與OP－OIM培養(yǎng)21 d誘導(dǎo)的AVICs鈣化效果相當(dāng)，IP－OIM誘導(dǎo)AVICs鈣化較OP－OIM縮短14 d，可替代OP－OIM快速有效地建立體外AVICs鈣化模型。

參考文獻(xiàn)