劉冰，孫曉，高進(jìn)，楊艷玲，吳秋月，生威，張燕，王碩

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

喹諾酮類藥物是通過抑制DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶，阻斷DNA的復(fù)制而產(chǎn)生抗菌作用[1]。諾氟沙星是第三代喹諾酮類抗菌藥，會(huì)阻礙消化道內(nèi)致病細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶的作用，阻礙細(xì)菌DNA復(fù)制，對細(xì)菌有抑制作用。由于分子結(jié)構(gòu)中引入了疏水性的氟原子及親水性的吡嗪環(huán)，諾氟沙星的抗菌活性得到提高，并且具有抗菌譜廣、高效、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖及畜牧養(yǎng)殖上廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的預(yù)防與治療[2,3]。但由于半衰期長，容易在動(dòng)物食品中的富集，通過食物鏈到達(dá)人體，對人體代謝有干擾作用，而且還破壞和減少體內(nèi)紅細(xì)胞、白細(xì)胞[4]，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)以及危害生態(tài)環(huán)境，因而殘留問題已引起極大的關(guān)注[5]。許多研究人員先后建立多種針對諾氟沙星殘留的檢測方法，微生物法[6]，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]，高效液相法[8]，毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光法[9]。上述方法雖靈敏度高，但儀器昂貴，對操作人員有較高要求，耗費(fèi)時(shí)間長等問題，并不適合進(jìn)行大量樣品篩查以及現(xiàn)場快速檢測[10]。

免疫層析技術(shù)是近幾年興起的快速檢測技術(shù)，最常見的形式是免疫層析試紙條技術(shù)，利用半抗原和抗體的特異性反應(yīng)，反應(yīng)靈敏且迅速，成本低廉，適合現(xiàn)場大量樣品同時(shí)檢測[11～13]，它結(jié)合了層析技術(shù)和免疫技術(shù)的特點(diǎn)，簡單，快速，結(jié)果可直接觀察?，F(xiàn)有試紙條的標(biāo)記材料雖然很多，但各自缺陷也較明顯，例如上轉(zhuǎn)換材料其合成過程復(fù)雜且不能裸視[14]；量子點(diǎn)具有一定毒性，觀察結(jié)果時(shí)需要儀器，不能裸眼可視，制約了量子點(diǎn)免疫層析試紙條的推廣及商業(yè)化[15]；膠體金是目前商品化試紙條中使用最多的標(biāo)記材料[16]，膠體金的制備簡單，顏色鮮艷，穩(wěn)定性極佳，但其信號(hào)放大成本高，靈敏度低且顏色單一；膠體碳標(biāo)記抗體耗時(shí)較長[17]，高質(zhì)量商業(yè)化碳納米顆粒較少。

乳膠微球是由高聚合材料合成的納米級(jí)球形的標(biāo)記材料，根據(jù)表面官能團(tuán)的不同可分為羧基化、氨基化、巰基化乳膠微球[18]，可以包裹不同顏色染料，使其顏色豐富，可滿足多種實(shí)驗(yàn)的要求，大小均勻，與膠體金相比，顆粒較大，用它作為標(biāo)記材料，可以節(jié)省抗體或抗原用量，成本更低，穩(wěn)定性更好，靈敏度更好，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于免疫技術(shù)、臨床診斷、細(xì)胞學(xué)等生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[19]，在食品檢測領(lǐng)域應(yīng)用較少。本實(shí)驗(yàn)采用藍(lán)色乳膠微球作為材料，建立喹諾酮類免疫層析試紙條方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、黏性PVC底板、吸水紙，上海金標(biāo)生物科技有限公司；玻璃纖維、聚酯纖維，上海金標(biāo)公司；硝酸纖維素膜，美國Millipore公司；諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，中國獸醫(yī)藥品檢查所；諾氟沙星單克隆抗體和諾氟沙星半抗原H3，實(shí)驗(yàn)室自制；羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、碳化二亞胺（1-ethyl-3-[3-(dimethylamino) propyl]carbodiimide，EDC）、卵白白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA），美國Sigma公司；氫氧化鈉（分析純）、碳酸氫鈉、氯化鈉，天津市化學(xué)試劑一廠；乙腈（分析純），德國 Merck公司；諾氟沙星試劑盒，美國REAGEN化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；ZK315B-1真空干燥箱，天津三水儀器有限公司；HM3035三維往復(fù)劃膜儀、ZQ2000全自動(dòng)斬切機(jī)，上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗體的純化

采用正辛酸-硫酸銨沉淀法純化小鼠腹水，具體純化操作步驟如下：取2 mL小鼠腹水，用0.06 M、pH 4.0的醋酸鈉-醋酸緩沖液進(jìn)行 3倍稀釋，然后用 1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為4.8；向上述混合溶液中逐滴加正辛酸，滴加過程要不斷低速攪拌，0.5 h內(nèi)加完，靜止放置于4 ℃冰箱2 h，以除去腹水中的雜蛋白和脂肪；取出后，4 ℃，14000 r/min離心30 min，取上清，棄沉淀；向上清液中加入約其體積 1/10 PB后用NaOH溶液將pH調(diào)至7.4左右；將上述溶液置于4 ℃條件，加入飽和硫酸銨繼續(xù)攪拌30 min；4 ℃，5000 r/min離心15 min，棄上清留沉淀；用適量pH 7.4 PB緩沖液溶解沉淀，但要少于純化前的體積，4 ℃ PB透析過夜；4 ℃，5000 r/min離心10 min，去除不溶性沉淀，稀釋一定的倍數(shù)。

1.2.2 包被原的制備

將4 mg諾氟沙星溶于200 μL DMF中，待全溶解后，準(zhǔn)確稱取6 mg NHS和20 mg EDC加入上述溶液中，在室溫避光條件下連續(xù)攪拌反應(yīng)24 h，冰浴條件下將上述溶液緩慢逐滴加入到含有11 mg OVA的2 mL PBS（pH 7.4）中，室溫繼續(xù)攪拌3 h后透析三天取出并添加一定劑量的防腐劑后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 藍(lán)色乳膠微球標(biāo)記抗體的方法

用pH 5.5 mes緩沖液洗滌50 mg/mL的藍(lán)色乳膠微球，重復(fù)2次，于14000 r/min，4 ℃，離心15 min；將沉淀用mes緩沖液稀釋至1 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆茫蝗?00 μL、1 mg/mL藍(lán)色乳膠微球，加入4 μL、0.5 mg/mL的EDC與NHS，在搖床反應(yīng)15 min；用磷酸鹽緩沖液洗滌已活化乳膠微球，重復(fù)2次，于14000 r/min，4 ℃，離心15 min，將沉淀用磷酸鹽緩沖液稀釋至1 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?；在攪拌速?50 r/min條件下將諾氟沙星抗體加入到上述藍(lán)色乳膠微球溶液中，在室溫下，于搖床反應(yīng)1 h，得藍(lán)色乳膠微球標(biāo)記抗體；加入4 μL 20%BSA封閉15 min；于14000 r/min，4 ℃，離心15 min；將最終沉淀用工作液重懸至40 μL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 免疫層析試紙條組裝圖

1.2.4 試紙條組裝纖維素膜上，37 ℃干燥12 h后，一端與層析墊重疊相連，另一端與吸水紙重疊相相連；層析墊與樣品墊重疊相連，組裝好試紙條，用斬條機(jī)將組裝好的試紙條進(jìn)行切割，置于干燥箱里保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 檢測方法

圖2 試紙條結(jié)果示意圖Fig.2 Results of immunochromatographic test strip

將用藍(lán)色乳膠微球標(biāo)記好的抗體置于微孔中，添加一定量標(biāo)品稀釋液，混合均勻，將試紙條插入微孔中，10 min后即可讀取結(jié)果。試紙條的原理是間接競爭，所以，如果兩條線都出現(xiàn)且顏色一致，即是陰性樣；如果T線顏色明顯變淺或消失，即是陽性樣；如果C線不出現(xiàn)，此條無效。

1.2.6 檢出限的確定

配制一系列的梯度標(biāo)品溶液，濃度分別為 0 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL；將試紙條插入微孔中，10 min后讀取結(jié)果。當(dāng)C、T線有明顯差別時(shí)，最低標(biāo)品濃度即為檢出限。

1.2.7 試紙條特異性的確定

本實(shí)驗(yàn)選取 12種喹諾酮類藥物用標(biāo)品稀釋液將其稀釋至0.1 mg/mL，用制備好的試紙條進(jìn)行檢測，每種藥物兩組平行，觀察試紙條的特異性，若在試紙條的檢測帶區(qū)域C、T均有藍(lán)色條帶，表明試紙條無交叉反應(yīng)；若只有C線顯色而T線無色則定為有交叉反應(yīng)；若C線無色則試紙條無效。

1.2.8 實(shí)際樣品的檢測

1.2.8.1 樣品前處理

取1 g樣品，加入0.2 mL 1 M NaOH，0.8 mL乙腈，高速漩渦10 min，14000 r/min高速離心10 min，用PBS稀釋10倍。

1.2.8.2 藍(lán)色乳膠微球標(biāo)記免疫層析試紙條檢測實(shí)際樣品

對陰性基質(zhì)通過添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品后采用上述前處理方法處理樣品，得到提取液，采用試紙條檢測并確定實(shí)際樣品的檢出限。

1.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將優(yōu)化好的試紙條密封保存，一個(gè)月，兩個(gè)月，三個(gè)月后，分別拿出密封干燥試紙條，濃度為 0 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋標(biāo)記后的抗體，觀察顯色情況及靈敏度。

1.2.10 商業(yè)化試劑盒驗(yàn)證試紙條方法的有效性

購買市售喹諾酮Elisa試劑盒，按照說明對樣品進(jìn)行前處理，并根據(jù)檢測步驟，對其中喹諾酮含量情況進(jìn)行檢測，同時(shí)，另取同樣的樣品，進(jìn)行試紙條前處理方法，進(jìn)行試紙條方法檢測，兩種方法得到檢測結(jié)果進(jìn)行比較，一致性好，說明試紙條方法有效性較好，若有較大差異，分析產(chǎn)生原因，對試紙條方法進(jìn)行改進(jìn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測限的確定

活化乳膠微球的最佳pH值為6.5，標(biāo)記抗體時(shí)的最佳pH值為5.7，最適抗體量為50 μg/mL，硝酸纖維素膜為MilliporeHF90s，二抗的稀釋倍數(shù)為 1:60，包被原的稀釋倍數(shù)1:40，微球標(biāo)記抗體的稀釋液為PBS緩沖液。制備標(biāo)記抗體和免疫層析試紙條，配制一系列梯度標(biāo)品溶液，將試紙條插入一定量的標(biāo)品溶液中，層析結(jié)束后觀察試紙條，如圖3所示。

圖3 藍(lán)色乳膠微球標(biāo)記免疫層析試紙條檢測限的確定Fig.3 Detection limit of immunochromatographic test strip labelled with blue latex microspheres

隨著諾氟沙星標(biāo)品濃度的升高，檢測線的顏色越來越淺，當(dāng)諾氟沙星標(biāo)品濃度為0 μg/L時(shí)，質(zhì)控線與檢測線出線且顏色基本一致；當(dāng)諾氟沙星標(biāo)品的濃度為1 μg/L時(shí)，質(zhì)控線與檢測線有明顯差別；當(dāng)諾氟沙星標(biāo)品的濃度為2 μg/L時(shí)，檢測線完全消失。所以，該試紙條的檢出限為1 μg/L。

2.2 特異性的確定

選擇喹諾酮類藥物，萘啶酸，環(huán)丙沙星，西諾沙星，恩氟沙星，氟羅沙星，奧林酸，吡哌酸，斯帕沙星，麻保沙星，依諾沙星，羅氟哌酸進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示，可以看出，有交叉的藥物是環(huán)丙沙星，恩氟沙星，氟羅沙星，麻保沙星，依諾沙星，羅氟哌酸；因此試紙條可檢測6種喹諾酮類藥品殘留。

圖4 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Cross-reaction with other quinolones drugs

圖5 實(shí)際樣品添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Recovery experimental results of the practical samples

2.3 實(shí)際樣品檢測

將提取液用標(biāo)品稀釋液進(jìn)行稀釋，當(dāng)稀釋 10倍后，使其顯色情況和靈敏度與優(yōu)化后一致，說明消除了基質(zhì)的影響。如圖5所示，在雞肉、蝦、豬肉三種樣品中，當(dāng)諾氟沙星的濃度為10 μg/kg時(shí)，質(zhì)控線與檢測線有明顯差異，隨著諾氟沙星濃度的升高，檢測線的顏色越來越淺，所以在實(shí)際樣品中的檢出限為10μg/kg。

2.4 試紙條穩(wěn)定性

將保存一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月的試紙條取出，分別檢測不同濃度的標(biāo)品。

結(jié)果顯示，保存三個(gè)月的試紙條C線條帶仍然清晰可見，T線顏色有所變淺；因此有效性良好，靈敏度有所下降。綜合上所述，試紙條的有效期至少兩個(gè)月。

表1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Stability of strips labelled with microspheres

2.5 試紙條準(zhǔn)確性

試劑盒結(jié)果與試紙條結(jié)果進(jìn)行比較，如表2所示，可見兩種方法檢測結(jié)果基本一致，表明本研究中建立的免疫層析試紙條方法檢測結(jié)果有效。

表2 試劑盒方法驗(yàn)證試紙條的有效性Table 2 Effectiveness of the strips validated by kits

3 結(jié)論

本研究中，將藍(lán)色乳膠微球作為標(biāo)記物，應(yīng)用于免疫層析試紙條中，通過優(yōu)化微球的活化條件、藍(lán)色乳膠微球標(biāo)記抗體條件及免疫層析條件，建立了檢測喹諾酮藥物的藍(lán)色乳膠微球免疫層析試紙條方法，試紙條的檢出限為1 μg/L；檢測時(shí)間為10 min；特異性良好，可以檢測環(huán)丙沙星，恩氟沙星，氟羅沙星，麻保沙星，依諾沙星，羅氟哌酸六種喹諾酮類藥物；雞肉、蝦和豬肉等實(shí)際樣品中的檢出限為10 μg/kg；穩(wěn)定性較好，有效期至少為3個(gè)月。

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