童雅琪，張羽，伍金娥,2，常超,2

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）（2.武漢輕工大學(xué)教育部大宗糧油精深加工省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）

抗雌激素藥物是一類人工合成的雌激素拮抗劑，廣泛應(yīng)用于激素依賴型疾?。ㄈ缛橄侔┖吐殉舶┑龋┑闹委?，這類藥物與激素類似，屬于內(nèi)分泌干擾物質(zhì)[1～5]。內(nèi)分泌干擾物質(zhì)所引發(fā)的一系列問題已經(jīng)引起了世界各國尤其是歐美和日本等發(fā)達(dá)國家的廣泛關(guān)注。雷洛昔芬（raloxifene，結(jié)構(gòu)式見圖 1）是一種抗性激素藥物，具有模仿激素的作用[6]，其內(nèi)分泌干擾作用也是值得關(guān)注的科學(xué)問題。已有數(shù)據(jù)表明，雷洛昔芬對(duì)生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)造成一定的危害[7～9]，甚至有致畸作用，易引起DNA損傷，造成基因毒性[10～12]。同時(shí)，可以通過對(duì)類固醇激素生物合成路徑中相關(guān)的基因表達(dá)、酶活效應(yīng)的干擾，改變生物體內(nèi)相應(yīng)性激素的含量，從而干擾生物體的正常發(fā)育和生長[13]。隨著雷洛昔芬在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥等疾病上的廣泛應(yīng)用，在環(huán)境水體中也檢測到了相應(yīng)的藥物殘留，不能完全消除[14,15]，這也與其他化學(xué)物質(zhì)的大量使用而造成的環(huán)境污染情況較相似，并且由于雷洛昔芬具有特殊的激素作用，雷洛昔芬有可能被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[16,17]。從環(huán)境水體間接污染和水產(chǎn)養(yǎng)殖直接使用兩方面來看，雷洛昔芬將是威脅食品安全的一大類新的化學(xué)藥物，研究抗性激素藥物的安全控制技術(shù)顯得十分必要。

目前國內(nèi)外關(guān)于雷洛昔芬的檢測主要是關(guān)于血漿[18～20]、藥物制劑[21～23]中的檢測，中國疾病控制中心報(bào)道了魚組織中雷洛昔芬檢測方法[24]，已有的檢測方法都是基于色譜法，色譜法具有準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，但是檢測成本高、設(shè)備昂貴、不適用于高通量的篩選檢測。而酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）方法具有快速、靈敏、高效等優(yōu)點(diǎn)，越來越廣泛地被用于大批量藥物殘留篩選，是食品安全檢測常用的篩選方法，目前國內(nèi)外未見抗性激素免疫化學(xué)方法的相關(guān)報(bào)道。本研究采用丁二酸酐對(duì)雷洛昔芬進(jìn)行改造合成雷洛昔芬半抗原，采用碳二亞胺法合成人工抗原，免疫動(dòng)物制備抗體，通過優(yōu)化抗原抗體反應(yīng)濃度初步建立雷洛昔芬ELISA方法，為建立污水和食品中雷洛昔芬免疫化學(xué)方法奠定基礎(chǔ)。

圖1 雷洛昔芬的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of raloxifene

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2月齡雄性健康新西蘭大白兔，體重1.5±0.5 kg，購于湖北省疾病預(yù)防控制中心。

1.1.2 試劑

鹽酸雷洛昔芬、他莫昔芬、丁二酸酐、托瑞米芬、氯米芬、二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司上海分公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、二環(huán)已基碳二亞胺（N,N-dicyclohexylcarbdiimide，DCC）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovabulmin，OVA），美國 sigma公司；羊抗兔 IgG-辣根過氧化物酶偶合物（goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase，GaR IgG-HRP），碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3 儀器

Aglient8453紫外分光光度計(jì)，美國Aglient公司；Magenllan CE 2.5型酶標(biāo)儀，瑞士Sunrise公司；Milli-Q超純水器，美國Millipore公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海維城。

1.2 方法

1.2.1 雷洛昔芬半抗原改造

圖2 雷洛昔芬的半抗原合成Fig.2 Synthesis of raloxifene hapten

雷洛昔芬半抗原改造見圖 2，具體操作方法：精確稱取鹽酸雷洛昔芬1.02 g，置于圓底燒瓶中，加入10 mL DMF作為溶劑，再加入丁二酸酐0.2 g，加熱回流5 h，冷卻待用。

1.2.2 雷洛昔芬免疫原的合成及鑒定

圖3 雷洛昔芬免疫原的合成Fig.3 Synthesis of raloxifene immunogen

雷洛昔芬免疫原的合成見圖 3，具體操作方法：采用碳二亞胺法將改造后的雷洛昔芬的羧基與載體蛋白上的氨基進(jìn)行偶聯(lián)。取出制備好的半抗原反應(yīng)物 1 mL，再加入 DMF1 mL，并在攪拌的過程中加入NHS23 mg，DCC41.2 mg，在4 ℃下攪拌反應(yīng)過夜，以5000 r/min離心10 min，上清液為A液。稱取BSA 340 mg，溶于10 mL 0.1 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液（phosphate belanced solution，PBS），攪拌并溶解制備B液。在磁力攪拌下，將A液逐滴加入到B液，密封燒杯，4 ℃下攪拌反應(yīng)4 h，以5000 r/min離心10 min，取上清液，4 ℃ PBS溶液（pH 7.4）透析3 d，每天更換PBS溶液1次，除去未反應(yīng)的NHS、DMF、DCC以及雷洛昔芬半抗原的小分子物質(zhì)。最后將無色免疫原溶液分裝，于-20 ℃冰箱中保存，以供免疫使用。產(chǎn)物經(jīng)紫外圖譜掃描鑒定。同法合成包被抗原。

1.2.3 免疫程序

取健康新西蘭大白兔6只，隨機(jī)分為2組，設(shè)計(jì)兩個(gè)劑量（0.5 mg/只、1 mg/只），免疫時(shí)間間隔均為30 d。將免疫原使用無菌生理鹽水配制成2 mg/mL，與等量的弗氏完全佐劑充分乳化后，進(jìn)行背部多點(diǎn)注射?；A(chǔ)免疫用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑。從第3次免疫開始，每次免疫后7～10 d 耳靜脈采血，監(jiān)測抗體質(zhì)量。

1.2.4 抗體質(zhì)量的監(jiān)測

抗體效價(jià)測定：直接ELISA測定抗體效價(jià)，將包被抗原用包被緩沖液倍比稀釋成8個(gè)濃度包被，置于4 ℃冰箱過夜。洗滌后用1%OVA封閉1 h，從首列開始加入倍比稀釋的待測血清，37 ℃避光反應(yīng)1 h。洗滌后加入 1:10000 的 GaR IgG-HRP 100 μL，37 ℃避光反應(yīng) 1 h。洗滌后每孔加入新鮮配制的底物溶液 100 μL，置37 ℃顯色10 min，每孔加入終止液50 μL，于450 nm測定各孔的吸光值，以光密度值（optical density，OD）1.0左右的抗血清稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。

抗體靈敏度測定：采用間接競爭ELISA測定，以抗體IC50值（抑制率為50%所對(duì)應(yīng)的藥物濃度）為指標(biāo)判定抗體靈敏度。抗體特異性測定：采用間接競爭ELISA程序測定，選擇結(jié)構(gòu)與雷洛昔芬類似的抗雌激素藥物做交叉反應(yīng)，以抗體的交叉反應(yīng)率為指標(biāo)判定抗體的特異性，交叉反應(yīng)率(%)=(雷洛昔芬 IC50值/其他競爭藥物IC50值)×100

1.2.5 方法的建立

采用方陣滴定法初步確定抗原抗體工作濃度，間接競爭ELISA法優(yōu)化抗原包被濃度、抗體工作濃度。在上述最佳條件下，將雷洛昔芬母液稀釋成0、0.4、1.6、6.4、25.6和102.4 μg/L，按間接競爭ELISA方法進(jìn)行測定，以雷洛昔芬溶液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中抑制率(%)=100*B/B0，B0和B分別為零標(biāo)準(zhǔn)孔和含藥物孔所對(duì)應(yīng)的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷洛昔芬人工抗原鑒定

圖4 雷洛昔芬人工抗原紫外圖譜，F(xiàn)ig.4 Ultraviolet spectra of raloxifene artificial antigen

雷洛昔芬免疫抗原和包被原的紫外圖譜見圖 4，如圖4a所示，載體蛋白BSA最大吸收波長為278 nm，雷洛昔芬最大吸收波長為296 nm，免疫原Ra-BSA最大吸收波長為290 nm，載體蛋白偶聯(lián)半抗原后最大吸收波長發(fā)生明顯改變，該現(xiàn)象可以提示半抗原與蛋白偶聯(lián)成功[25]。紫外測定結(jié)果初步證明雷洛昔芬與BSA偶聯(lián)成功，同理初步推斷雷洛昔芬與 OVA偶聯(lián)成功（圖4b）。

2.2 抗體效價(jià)與靈敏度

表1 各免疫組抗體的效價(jià)與靈敏度Table 1 Antibody titers and sensitivities for each immunization group

免疫3次后，直接ELISA測定各免疫組效價(jià)，間接競爭ELISA測定IC50，結(jié)果見表1。

各免疫大白兔均有免疫反應(yīng)，高劑量組（1 mg/只）效價(jià) 6.4×104～1.28×105，低劑量組（0.5 mg/只）效價(jià) 1.6×104～3.2×104，其中效價(jià)最高為 1.28×105，抗體效價(jià)的產(chǎn)生也佐證了雷洛昔芬人工抗原合成成功。靈敏度結(jié)果顯示，1號(hào)實(shí)驗(yàn)兔（Rab-1）所產(chǎn)生的抗體最靈敏，IC50為16.8 μg/L，故選擇Rab-1抗體初步建立ELISA方法。

2.3 抗體特異性

抗體與其他結(jié)構(gòu)類似的抗雌激素藥物交叉反應(yīng)如表2所示，抗體除了能與雷洛昔芬小分子特異性結(jié)合，與其他結(jié)構(gòu)類似抗雌激素沒有交叉反應(yīng)，說明本抗體特異性好，可以特異地捕獲雷洛昔芬。

表2 抗體與其他結(jié)構(gòu)類似抗雌激素的交叉反應(yīng)Table 2 Cross-reactivity of antibodies with other anti- estrogens

2.4 方法的建立

2.4.1 抗原抗體初步工作濃度的確定

采用方陣滴定法，確定抗原抗體初步工作濃度（表3），以O(shè)D值在1.0左右所對(duì)應(yīng)的抗原濃度（400μg/L）和抗體稀釋倍數(shù)（1:128000）為最初工作濃度，進(jìn)一步優(yōu)化最優(yōu)的抗原抗體工作濃度。

表3 方陣滴定結(jié)果Table 3 Results of chessboard titration

2.4.2 抗原最佳包被濃度

表4 包被不同抗原濃度的IC50值Table 4 IC50 values for different antigen concentrations

以表3中確定的包被抗原濃度400 μg/L為中心濃度，設(shè)計(jì)5個(gè)濃度梯度，采用間接競爭ELISA，測定包被不同抗原濃度的IC50見表4。

結(jié)果表明，包被300 μg/L的抗原，IC50最小，此濃度下抗體反應(yīng)最靈敏。

2.4.3 抗體最佳工作濃度

表5 不同抗體濃度的IC50值Table 5 IC50 values for different antibody concentrations

以表3中確定的抗體工作濃度1.2×105為中心濃度，設(shè)計(jì)5個(gè)濃度梯度，采用間接競爭ELISA，測定不同抗體工作濃度的IC50見表5。結(jié)果表明，抗體稀釋倍數(shù)為1.0×105，IC50最小，抗體反應(yīng)最靈敏。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve for raloxifene

在最優(yōu)的抗原抗體工作濃度下建立雷洛昔芬標(biāo)準(zhǔn)曲線，以抑制率為縱坐標(biāo)，雷洛昔芬濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)果見圖5。曲線在0.4～102.4 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系好，R2=0.9853，最低檢測能力可達(dá)0.4 μg/L。

3 討論

高質(zhì)量的抗體是建立免疫化學(xué)方法的基礎(chǔ)，而高質(zhì)量的抗體取決于小分子半抗原的改造和人工抗原的合成。雷洛昔芬屬小分子化合物，屬于半抗原，沒有免疫原性，必須與載體蛋白偶聯(lián)才才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。雷洛昔芬分子式上有活性的羥基，不能直接與載體蛋白偶聯(lián)，需要進(jìn)行人工改造。丁二酸酐法是改造羥基最常用的方法，碳二亞胺法是偶聯(lián)羧基最常用的方法[26]。

本研究運(yùn)用丁二酸酐法對(duì)雷洛昔芬進(jìn)行衍生改造，引入活性基團(tuán)羧基，采用碳二亞胺法將雷洛昔芬與載體蛋白偶聯(lián)，通過紫外圖譜掃描和動(dòng)物免疫試驗(yàn)顯示雷洛昔芬半抗原和人工抗原合成成功，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。免疫劑量對(duì)抗體的質(zhì)量也會(huì)產(chǎn)生很大的影響，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（表 1）顯示出低劑量的免疫原較高劑量的免疫原更易產(chǎn)生高效價(jià)、靈敏的抗體，這與先前的報(bào)道一致[27]，其原因可能是低劑量抗原長時(shí)間刺激B細(xì)胞，有助于B細(xì)胞識(shí)別抗原，更易產(chǎn)生高效價(jià)的抗體?？乖贵w的工作濃度也是影響ELISA靈敏度的一個(gè)重要因素，本研究摸索了不同抗原抗體濃度對(duì)方法靈敏度的影響，結(jié)果顯示出，在方陣滴定的結(jié)果基礎(chǔ)上，降低抗原抗體濃度有助于提高方法的靈敏度，這與先前的報(bào)道一致[28]。方法的檢測限是評(píng)價(jià)方法的重要指標(biāo)，本方法最低檢測能力可達(dá) 0.4μg/L，與肖甚圣[24]建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的最低檢測能力（0.3 μg/L）接近，可用于水體中雷洛昔芬的篩查。

4 結(jié)論

本研究完成了雷洛昔芬抗體的制備和 ELISA檢測方法的初步建立，所制備的抗體效價(jià)高，特異性好。通過對(duì)抗原抗體反應(yīng)濃度的優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.4～102.4 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系好，R2=0.9926，最低檢測能力0.4 μg/L。本方法可以用于水體中雷洛昔芬的篩查，但對(duì)于食品基質(zhì)中的檢測，還需要進(jìn)一步研究食品基質(zhì)對(duì)方法的影響，包括樣品的提取凈化、準(zhǔn)確度以及精密度等。

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