余宗苡，閆文君，魏東

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

酵母作為世界上研究最多的微生物之一，被廣泛應(yīng)用于釀酒、食品、醫(yī)藥、飼料和化妝品等領(lǐng)域。廢糖蜜是酵母工業(yè)的主要原料，包括甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。目前我國兩種原料的使用率基本各占50%。酵母廢水有機(jī)物濃度高，COD（化學(xué)需氧量）、BOD（生化需氧量）、SS（懸浮物）均較高，且廢水呈酸性，直接排放會(huì)使土壤酸化板結(jié)，使土壤貧瘠化，危害植物生長繁殖[1]。由于酵母發(fā)酵過程不能把糖蜜中的有機(jī)物完全消耗，剩余的有機(jī)物以及酵母生長代謝產(chǎn)生的新的有機(jī)物進(jìn)入酵母工業(yè)廢水中，因此這類廢水因含有類黑精、美拉德色素和多酚類等色素而呈深棕色，其色值還可能由于色素物質(zhì)的再聚合而加深[2]。目前，國內(nèi)外處理此類廢水的方法包括物理處理法、生化處理法、深度處理法、生物與其他方法結(jié)合處理[3]。

微藻是一類光合效率很高的初級(jí)生產(chǎn)者，在生長過程中能夠吸收廢水中大量的氮、磷，以維持自身的生長與增殖需要，是最具潛力的生物質(zhì)能源[4]，利用微藻處理酵母廢水可以將廢水中豐富的無機(jī)微量元素進(jìn)行資源化綜合利用[5]，迄今已經(jīng)篩選出了許多高效凈化水質(zhì)的藻種[6]尤以綠藻居多[7]。大部分微藻都可以利用不同碳源進(jìn)行異養(yǎng)或者混養(yǎng)培養(yǎng)生長，相對(duì)于自養(yǎng)生長，異養(yǎng)或者混養(yǎng)培養(yǎng)可獲得較高的生物量[8]。研究表明小球藻采用分批及流加培養(yǎng)分別可獲得 48 g/L、105 g/L的生物量，因此，可通過異養(yǎng)培養(yǎng)獲得大量藻生物量來去除廢水中的“營養(yǎng)物”，實(shí)現(xiàn)廢水的資源化[9]。

膠球藻C-169是在極地環(huán)境中生存的一個(gè)代表物種，對(duì)外界環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，在CO2驅(qū)動(dòng)下可提高生物量和油脂產(chǎn)率[10]。其細(xì)胞壁薄而容易酶解，在最佳條件下能積累大量的甘油三酯，用于微藻生物燃料的生產(chǎn)可極大降低提油成本，是一種極具潛力的能源微藻[11]。目前國內(nèi)外對(duì)該藻種的基礎(chǔ)生物學(xué)信息了解不多，局限于光自養(yǎng)培養(yǎng)，細(xì)胞密度低，對(duì)其能否通過異養(yǎng)發(fā)酵和混養(yǎng)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)并無研究，是否能利用廢水培養(yǎng)并積累油脂從而降低微藻油脂的生產(chǎn)成本報(bào)道很少。因此，探索膠球藻C-169營養(yǎng)方式、處理廢水及積累油脂的能力是目前有待進(jìn)行的研究課題，這些基礎(chǔ)生物學(xué)信息將為膠球藻 C-169的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膠球藻(Coccomyxa subellipsoidea)NIES 2166（C-169）原種購于日本NIES藻種庫；糖蜜酵母廢水來自廣東五洲藥業(yè)有限公司；葡萄糖、硝酸鈉、硫酸鎂等均為分析純；測COD、總氮、總磷的試劑購自美國HACH公司；AL104型電子天平和SevenEasy型pH計(jì)購自瑞士Mettler Toledo公司；Allegra25R型高速冷凍離心機(jī)購自美國 Beckman Coulter公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHZ-DA型恒溫?fù)u床購自太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；BFM-6BⅡ型高壓滅菌鍋購自英國 ASTELL公司；DRB200型數(shù)字式消解器和DR2700型便攜式分光光度計(jì)購自美國HACH公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠球藻C-169的自養(yǎng)、異養(yǎng)、混養(yǎng)生長

從活化的Basal培養(yǎng)基[12]平板上挑取單藻落，接種到含10 g/L葡萄糖的液體basal培養(yǎng)基中。培養(yǎng)6 d后，在超凈工作臺(tái)中，取5 μL接種到不含糖的Basal固體培養(yǎng)基平板上，置于連續(xù)光照（光強(qiáng) 2000±300 lux）的培養(yǎng)箱中，27 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察自養(yǎng)生長情況；在超凈工作臺(tái)取5 μL接種到含10 g/L葡萄糖及10 g/L蔗糖的Basal固體培養(yǎng)基平板上置于連續(xù)光照（光強(qiáng)2000±300 lux）的培養(yǎng)箱中，27 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察混養(yǎng)生長情況；取5 μL接種到含10 g/L葡萄糖及10 g/L蔗糖的Basal固體培養(yǎng)基平板上置于黑暗的培養(yǎng)箱中，27 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察異養(yǎng)生長情況。

配制Basal培養(yǎng)基，分裝到9個(gè)250 mL三角瓶中，裝液量為100 mL，其中6瓶添加10 g/L葡萄糖。121 ℃蒸汽滅菌 15 min冷卻至室溫后，在超凈臺(tái)中以 5%（V/V）接種量完成接種后，取三瓶含有葡萄糖的三角瓶用錫紙包裹完全避光，培養(yǎng)瓶均置于光照強(qiáng)度為4000±300 lux、27 ℃、150 r/min 的搖床中培養(yǎng) 10 d。每隔24 h取樣一次，每次取樣2 mL，高速離心去上清。藻泥用去離子水洗滌3次，置于60 ℃烘箱48 h后測干重。

1.2.2 葡萄糖濃度對(duì)膠球藻C-169混養(yǎng)生長的影響

設(shè)置葡萄糖濃度梯度10、20、30、40、50、60 g/L，將培養(yǎng)瓶置于光照強(qiáng)度為4000±300 lux，27 ℃、150 r/min的搖床中混養(yǎng)培養(yǎng)10 d。每隔24 h取樣一次，每次取樣2 mL，12000 r/min高速離心，收集上清和藻泥。

1.2.3 濃縮種子液制備

在250 mL三角瓶中以10%（V/V）的接種量將預(yù)先培養(yǎng)的一級(jí)種子液接入100 mL Basal培養(yǎng)基中（添加20 g/L葡萄糖），置于恒溫?fù)u床27 ℃、150 r/min混養(yǎng)培養(yǎng)6 d。取6瓶種子液，分裝到50 mL滅菌離心管中，6000 r/min高速離心3 min，去上清，用無菌去離子水懸浮藻細(xì)胞，重復(fù)離心洗滌3次后，用無菌去離子水懸浮藻細(xì)胞定容至80 mL，該濃縮藻液作為后期實(shí)驗(yàn)的種子液。

1.2.4 酵母廢水脫色預(yù)處理

將冷凍的糖蜜酵母廢水解凍至室溫，使其混合均勻后，用10%的鹽酸溶液調(diào)整其pH值至3.0。取200 mL酵母廢水至500 mL燒杯中，按濃度為3 g/100 mL的劑量添加活性碳粉200#，置于磁力攪拌器上以300 r/min攪拌0.5 h后，分別用200、300、400目篩絹真空抽濾除去大部分活性炭，再分別用定性濾紙、0.45 μm水相濾膜真空抽濾除去殘留的活性炭。

1.2.5 接種密度對(duì)脫色廢水中膠球藻C-169的生長和廢水凈化效果的影響

取900 mL脫色廢水，用4 mol/L的NaOH溶液調(diào)整其pH值至6.1，分裝到9個(gè)滅菌250 mL三角瓶中，裝液量為100 mL。在非滅菌的脫色廢水中接種膠球藻C-169，接種量按1、2、4 mL加入濃縮的種子液，每個(gè)接種濃度設(shè)置三個(gè)平行。把培養(yǎng)瓶置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，27 ℃、150 r/min下連續(xù)光照培養(yǎng)4 d，光強(qiáng)為4500±500 lux。培養(yǎng)起始和結(jié)束時(shí)各取樣3 mL藻液，12000 r/min離心3 min，收集上清液用于脫色廢水的水質(zhì)分析。

1.2.6 脫色廢水濃度對(duì)膠球藻C-169的生長和廢水凈化效果的影響

將脫色廢水與去離子水分別按1:0、1:1、1:2、1:3比例混合，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行，用4 mol/L NaOH溶液調(diào)整其pH值至6.1，分裝到12個(gè)滅菌后的250 mL三角瓶中，裝液量為100 mL。在非滅菌的脫色廢水中接種膠球藻C-169，接種量按4 mL體積加入濃縮藻液。三角瓶置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，在27 ℃、150 r/min下連續(xù)光照培養(yǎng)10 d，光強(qiáng)為4500±500 lux。每隔48 h取樣3 mL，12000 r/min離心3 min，收集上清液進(jìn)行脫色廢水水質(zhì)分析。

1.3 分析測試

1.3.1 葡萄糖濃度

葡萄糖濃度測定在 SBA-40D生物傳感分析儀上進(jìn)行，校正范圍為0.5～1.0 g/L。測定前將樣品稀釋到矯正范圍內(nèi)，用針筒過濾器進(jìn)行過濾（0.45 μm）。進(jìn)樣前先用濃度為1.0 g/L葡萄糖標(biāo)液定標(biāo)。進(jìn)樣時(shí)用微量進(jìn)樣器吸取25 μL樣品從進(jìn)樣口注入反應(yīng)池，由反應(yīng)池?cái)嚢柘到y(tǒng)均勻，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品經(jīng)過多次測量取平均值，再乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品的葡萄糖濃度。

1.3.2 生物量

采用烘干法測干重時(shí)，經(jīng)離心、反復(fù)洗滌后的藻泥，放入60 ℃烘箱烘干至恒重。廢水培養(yǎng)所得藻泥用去離子水懸浮，1200 r/min離心5 min，去除懸浮有細(xì)菌的上清液，重復(fù)5次后，上清液基本無色透明，然后轉(zhuǎn)移至已稱恒重的2 mL離心管中，12000 r/min離心3 min，去除上清后置于60 ℃烘箱烘至恒重，差量法得干重。

1.3.3 比生長速率

根據(jù)生物量干重變化制作生長曲線，比生長速率μ=(lnM2-lnM1)/t，其中M2和M1分別是兩次測量的生物量干重濃度值；t為兩次測量的時(shí)間間隔，單位為d。

1.3.4 酵母廢水COD、TN、TP測定

使用HACH公司專用試劑盒，按照試劑盒操作步驟，樣品稀釋到測量范圍，加入試劑后在不同溫度下于消解器DRB200上進(jìn)行消解，消解完全并冷卻后，在DR2700分光光度計(jì)中測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microcal Origin V8.0 Software對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同營養(yǎng)模式下膠球藻C-169的生長特性

圖1 膠球藻C-169在固體培養(yǎng)基上的異養(yǎng)、自養(yǎng)和混養(yǎng)生長Fig.1 Heterotrophic, mixotrophic and autotrophic growth of Coccomyxa subellipsoidea C-169 on solid medium

圖2 膠球藻C-169在異養(yǎng)、混養(yǎng)和自養(yǎng)條件下的生長曲線Fig.2 Growth curves of Coccomyxa subellipsoidea C-169 under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic conditions

膠球藻C-169在含10 g/L葡萄糖或含10 g/L蔗糖的Basal固體培養(yǎng)基平板上異養(yǎng)和混養(yǎng)生長狀況如圖1所示。從圖中可以看出，膠球藻C-169除了能夠利用無機(jī)碳進(jìn)行光自養(yǎng)生長以外，還能夠利用葡萄糖和蔗糖作為碳源，可以進(jìn)行混養(yǎng)和異養(yǎng)生長。膠球藻C-169在自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)（都含10 g/L葡萄糖）Basal液體培養(yǎng)基中的生長曲線見圖 2。研究表明，混養(yǎng)培養(yǎng)下既能進(jìn)行光合作用又能利用葡萄糖作為有機(jī)碳源進(jìn)行細(xì)胞增殖，平均比生長速率和最大生物量干重顯著大于異養(yǎng)和自養(yǎng)，最大生物量干重分別是異養(yǎng)和自養(yǎng)的1.86、7.79倍。

2.2 葡萄糖濃度對(duì)膠球藻C-169混養(yǎng)生長的影響

圖3 膠球藻C-169在不同葡糖糖濃度下混養(yǎng)葡萄糖消耗曲線和生長曲線Fig.3 Consumption curves of glucose (a) and growth curves(b) of Coccomyxa subellipsoidea C-169 in mixotrophic culture medium with different glucose concentrations

膠球藻C-169在葡萄糖濃度梯度為10～60 g/L的Basal培養(yǎng)基中混養(yǎng)培養(yǎng)，細(xì)胞生長曲線和葡萄糖消耗情況如圖3所示。由圖3a可以看出，在不同葡萄糖濃度下，膠球藻C-169的生長為典型的S曲線。接種處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，無明顯延滯期。葡萄糖濃度為10 g/L時(shí)，膠球藻C-169在6 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，葡萄糖在第6 d完全消耗（圖3b）。

當(dāng)葡萄糖在20～60 g/L時(shí)，膠球藻C-169在8 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，但其對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的葡萄糖尚有剩余。由此可知，當(dāng)葡萄糖濃度為10～20 g/L時(shí)，葡萄糖短缺是混養(yǎng)膠球藻C-169的生長限制性因素。當(dāng)葡萄糖濃度為20～60 g/L時(shí)，可能是某些代謝產(chǎn)物或者其他營養(yǎng)源（氮源、微量元素等）限制了C-169的繼續(xù)生長。20 g/L葡萄糖濃度下的生物量較10 g/L葡萄糖濃度下的生物量有極顯著的提高（p＜0.01），30～40 g/L葡萄糖濃度下的生物量較20 g/L葡萄糖濃度下的生物量沒有顯著影響，50 g/L葡萄糖濃度以上的生物量較40 g/L葡萄糖濃度下的生物量有極顯著的降低（p＜0.01）。

有研究表明，在小球藻的培養(yǎng)基中磷的耗竭對(duì)脂質(zhì)積累沒有影響，但限制了細(xì)胞的生長；而氮的耗竭可以促進(jìn)脂質(zhì)的積累，從而有利于油脂的產(chǎn)生；當(dāng)葡萄糖濃度小于100 g/L時(shí)，葡萄糖的抑制作用與滲透壓脅迫相當(dāng)，葡萄糖濃度高于100 g/L時(shí)的抑制作用會(huì)變得比滲透壓脅迫強(qiáng)，在特定的高滲透壓脅迫下可顯著提高油脂積累[13]。

在本試驗(yàn)中，50 g/L以上葡萄糖濃度對(duì)膠球藻C-169的混養(yǎng)生長有一定的抑制作用。經(jīng)顯著性分析和培養(yǎng)基成本考慮可得，膠球藻C-169在20 g/L葡萄糖濃度Basal培養(yǎng)基中獲得較高生物量濃度7.98 g/L，本研究的后期實(shí)驗(yàn)將以20 g/L葡萄糖添加量混養(yǎng)培養(yǎng)進(jìn)行快速擴(kuò)種。

2.3 接種密度對(duì)膠球藻C-169生長和廢水凈化效果的影響

圖4 不同起始細(xì)胞濃度下膠球藻C-169在脫色廢水中生長4 d時(shí)的情況Fig.4 Growth of Coccomyxa subellipsoidea C-169 in yeast wastewater under different initial cell concentrations for 4 d

接種起始細(xì)胞密分別為0.59 g/L、1.18 g/L和2.43 g/L。圖4可以看出，接種起始細(xì)胞密為0.59 g/L時(shí)膠球藻C-169在脫色廢水中無法持續(xù)生長，藻液顏色發(fā)白。這是因?yàn)槊撋珡U水未經(jīng)過滅菌處理，藻細(xì)胞密度低，用流式細(xì)胞儀測得其他微生物生長迅速，藻細(xì)胞逐漸減少最后死亡。接種起始細(xì)胞密為1.18 g/L、2.43 g/L時(shí)藻液呈綠色，微藻細(xì)胞密度大，形成優(yōu)勢群落，生長旺盛。

培養(yǎng)4 d后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行水質(zhì)分析，結(jié)果見表1。從表中可看出，接種量為4 mL時(shí)，COD、總氮、總磷去除率要顯著高于接種量為2 mL時(shí)（p＜0.01），廢水凈化程度與藻細(xì)胞濃度呈正相關(guān)，起始細(xì)胞密度越大，藻細(xì)胞生長速率越快，廢水凈化效果越好。研究表明，利用膠球藻C-169在藻菌共生條件下凈化脫色廢水時(shí)，接種密度在1 g/L以上的藻細(xì)胞能有較好的生長狀態(tài)，且接種密度越高，廢水凈化效果越好。工業(yè)上用“活性藻”技術(shù)處理廢水時(shí)，是把濃縮藻液接種到活性污泥中進(jìn)行藻菌共生，可見微藻接種密度低不利于藻菌共生系統(tǒng)的運(yùn)行。本文之后實(shí)驗(yàn)的接種量設(shè)置為4 mL濃縮藻液，接種密度可能會(huì)由于一級(jí)種子液濃度不同存在變化，但均在1 g/L以上。

表1 不同起始細(xì)胞密度下膠球藻C-169對(duì)酵母廢水凈化效果Table 1 Purification effect of yeast wastewater by Coccomyxa subellipsoidea C-169 under different initial cell densities

2.4 脫色廢水濃度對(duì)膠球藻C-169生長和廢水凈化效果的影響

圖5 不同脫色廢水濃度下膠球藻C-169的生長曲線Fig.5 Growth curve of Coccomyxa subellipsoidea C-169 under different concentrations of decolorization wastewater

不同濃度脫色廢水培養(yǎng)基的總氮、總磷含量見表2，膠球藻C-169在不同濃度脫色廢水中的生長情況見圖5。從圖5可以看出，C-169在不稀釋的脫色酵母廢水中生長2 d后，藻細(xì)胞停止生長，進(jìn)入穩(wěn)定期，最大生物量干重為3.63 g/L。C-169在稀釋一倍的脫色廢水中快速生長4 d后，停止生長，生物量干重直線下降，原因可能是這種培養(yǎng)基更適合其他微生物的生長，導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。C-169在稀釋兩倍時(shí)，最高生物量濃度和產(chǎn)率都達(dá)到最高，分別為 5.28 g/L和 0.23 g/(L·d)。說明，廢水稀釋降低了其高負(fù)荷，增大了培養(yǎng)基透光率，相較于原脫色廢水，更加有利于藻細(xì)胞進(jìn)行光合作用。當(dāng)稀釋倍數(shù)為3時(shí)，其總氮含量與標(biāo)準(zhǔn)Basal培養(yǎng)基相比，氮源充足，其細(xì)胞生長速率低于稀釋兩倍時(shí)，可能是稀釋過程降低了磷及其他營養(yǎng)元素的濃度，限制了C-169的生長。紀(jì)雁[14]利用味精廢水培養(yǎng)普通小球藻，當(dāng)稀釋倍數(shù)為100時(shí)，獲得最大生物質(zhì)產(chǎn)率，稀釋倍數(shù)過高和過低均不適合普通小球藻的生長。這與本研究稀釋酵母廢水培養(yǎng)膠球藻C-169的規(guī)律相同，且脫色酵母廢水稀釋兩倍即達(dá)到最適稀釋倍數(shù)，節(jié)約淡水，更適合利用微藻凈化。

表2 不同濃度脫色酵母廢水中總氮、總磷含量與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的比較Table 2 Comparison of total nitrogen and total phosphorus content in different concentrations of yeast fermentation wastewater with standard medium

表3 不同濃度脫色酵母廢水培養(yǎng)膠球藻C-169凈化脫色酵母廢水的效果Table 3 Purification effect of yeast decolorization wastewater with different concentrations by Coccomyxa subellipsoidea C-169

比較不同濃度脫色酵母廢水中膠球藻C-169對(duì)廢 水的凈化效果，其結(jié)果如表3所示。稀釋三倍的脫色廢水中培養(yǎng)膠球藻，COD去除率顯著低于其他組（p≤0.05）；稀釋兩倍時(shí)COD去除率與原脫色廢水、稀釋一倍的廢水沒有顯著差異其總氮去除率分別是原脫色廢水、稀釋一倍廢水、稀釋三倍廢水的2.76、1.99、1.08倍；稀釋兩倍時(shí)總磷去除率高達(dá)96.86%，氨氮去除率分別是原脫色酵母廢水、稀釋一倍廢水、稀釋三倍廢水的4.69、3.69、1.29倍。氮、磷去除率的規(guī)律和膠球藻C-169生長規(guī)律一致，說明膠球藻C-169生長消耗廢水中氮磷是去除廢水總氮、總磷的主要原因。稀釋兩倍的脫色酵母廢水，更適合膠球藻C-169的生長，細(xì)胞密度較高，能更多消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)元素，提高去除率。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)膠球藻C-169的生長特性以及其對(duì)酵母廢水的處理凈化能力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明膠球藻C-169具有利用葡萄糖和蔗糖作為碳源進(jìn)行異養(yǎng)和混養(yǎng)生長的能力，且混養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)采用葡萄糖濃度為 20 g/L的Basal培養(yǎng)基是膠球藻C-169快速擴(kuò)種的最佳條件。膠球藻C-169能夠在高濃度脫色酵母廢水中，藻菌共生條件下生長，接種密度越大，對(duì)酵母廢水的凈化效果越佳。脫色酵母廢水稀釋兩倍最適合膠球藻C-169的生長和酵母廢水的凈化。

[1]趙光楠,李曉琳,吳德東.酵母生產(chǎn)廢水處理方法對(duì)比研究[J].林業(yè)科技情報(bào),2016,48(3):59-64 ZHAO Guang-nan, LI Xiao-lin, WU De-dong. Comparative study on treatment methods of wastewater from yeast production [J]. Forestry Science and Technology Information,2016, 48(3): 59-64

[2]Liakos T I, Lazaridis N K. Melanoidins removal from simulated and real wastewaters by coagulation and electro-flotation [J]. Chemical Engineering Journal, 2014,242(15): 269-277

[3]Westlund P, Yargeau V. Investigation of the presence and endocrine activities of pesticides found in waste water effluent using yeast-based bioassays [J]. Science of the Total Environment, 2017, 607-608: 744

[4]Park J, Jin H F, Lim B R,et al.Ammonia removal from anaerobic digestion effluent of livestock waste using green alga scenedesmus sp [J]. Bioresource Technology, 2010,101(22): 8649-8657

[5]Mthakathi N T, Chen W, Yu JH, et al.Cytochrome P450 monooxygenase analysis in free-living and symbiotic microalgae Coccomyxa sp. C-169 and Chlorella sp. NC64A.In: International Symposium on Cytochrome P450 Biodiversity and Biotechnology, Event # 16scbb, July 22-26,2016, Vancouver, Canada, 2015: 233-239

[6]Lürling M. Phenotypic plasticity in the green algae Desmodesmus and Scenedesmus with special reference to the induction of defensive morphology [J]. Annales de Limnologie-International Journal of Limnology, 2003, 39(2):85-101

[7]Ruizmarin A, Mendozaespinosa L G, Stephenson T. Growth and nutrient removal in free and immobilized green algae in batch and semi-continuous cultures treating real wastewater[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(1): 58

[8]Hu J, Nagarajan D, Zhang Q, et al.Heterotrophic cultivation of microalgae for pigment production: A review [J].Biotechnology Advances, 2017

[9]廖福真,龍先進(jìn),黃浩,等.利用酵母有機(jī)廢水高密度異養(yǎng)培養(yǎng)油脂微藻的研究[J].輕工科技,2017,1:79-81 LIAO Fu-zhen, LONG Xian-jin, HUANG Hao,et al.High density heterotrophic cultivation of lipid microalgae using yeast organic wastewater [J]. Light Industry Science and Technology, 2017, 1: 79-81

[10]Peng H, Wei D, Chen G, et al.Transcriptome analysis reveals global regulation in response to CO2supplementation in oleaginous microalga Coccomyxa subellipsoidea C-169 [J].Biotechnology for Biofuels, 2016, 9(1): 151

[11]Allen J W, Dirusso C C, Black P N. Triacylglycerol synthesis during nitrogen stress involves the prokaryotic lipid synthesis pathway and acyl chain remodeling in the microalgaeCoccomyxa subellipsoidea[J]. Algal Research,2015,(10):110-120

[12]Ogbonna J C, Masui H, Tanaka H. Sequential heterotrophic/autotrophic cultivation-An efficient method of producing Chlorella biomass for health food and animal feed[J]. Journal of Applied Phycology, 1997, 9(4): 359-366

[13]Wang T, Tian X, Liu T, et al.A two-stage fed-batch heterotrophic culture of Chlorella protothecoides that combined nitrogen depletion with hyperosmotic stress strategy enhanced lipid yield and productivity [J]. Process Biochemistry, 2017

[14]紀(jì)雁.利用味精廢水培養(yǎng)普通小球藻以及養(yǎng)藻廢水的生物強(qiáng)化處理[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2014 JI Yan. Cultivation ofChlorella vulgariswith monosodium glutamate wastewater and treatment of the residule medium by bioaugmentation [D]. Jinan: Shandong University, 2014