徐曉敏，黃奎，韓雙艷

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

肉桂醇具有類(lèi)似風(fēng)信子的令人愉快的香氣，其脂肪酸酯也是非常重要的芳香類(lèi)化合物，廣泛應(yīng)用于食品，日化以及醫(yī)藥行業(yè)[1]。目前，市面上的肉桂醇酯絕大部分是由化學(xué)方法合成[2～4]?；瘜W(xué)方法在生產(chǎn)香精香料的過(guò)程中，常伴隨著多種副產(chǎn)物的生成，大大影響了產(chǎn)物的品質(zhì)，并且具有反應(yīng)環(huán)境苛刻，對(duì)設(shè)備要求高，產(chǎn)物分離困難等缺點(diǎn)[5～7]。

國(guó)際立法規(guī)定，“天然”風(fēng)味物質(zhì)只能通過(guò)物理過(guò)程（從天然產(chǎn)物提取）、酶促或微生物處理來(lái)制備[8]。酶法合成香料以其反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物純度高，立體選擇性好以及環(huán)境友好等特點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。為酶促合成香料反應(yīng)找到適宜的生物催化劑，使該方法能大規(guī)模使用[9～13]具有廣泛的經(jīng)濟(jì)效益。

用于催化反應(yīng)的脂肪酶主要有游離和固定化兩種形式[14～18]，在實(shí)際應(yīng)用的過(guò)程中，游離酶存在分離困難，難以回收重復(fù)利用等問(wèn)題，目前應(yīng)用于肉桂醇酯合成的酶制劑主要為商業(yè)化的固定化脂肪酶，Novozyme435[19,20]。但其成本較高，因此發(fā)展廉價(jià)易得的新酶源顯得迫在眉睫。

南極假絲酵母脂肪酶 B(Candida antarcticalipaseB，CALB)是用途最為廣泛的脂肪酶之一，具有很高的催化活性，以表面展示南極假絲酵母脂肪酶B的畢赤酵母為全細(xì)胞催化劑（Pp-CALB），不但具有固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，而且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單[21,22]，能夠有效降低生產(chǎn)成本。Han等[23]利用Flo1p絮凝素將米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor mieheilipase，RML)展示在畢赤酵母表面，Huang等[24]用其催化大豆油的醇解反應(yīng)制備生物柴油，72 h甲酯產(chǎn)率達(dá)到83%。Su等[25]利用凝集素將CALB展示在畢赤酵母表面，發(fā)現(xiàn)其水解活力要比釀酒酵母展示的CALB高10倍，接近商品酶Novozyme 435，在有機(jī)相合成丙酸乙酯和乙酸乙酯，反應(yīng)9 h底物摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上。由于畢赤酵母能進(jìn)行高密度發(fā)酵，與釀酒酵母相比，畢赤酵母展示CALB能夠有效降低全細(xì)胞催化劑的生產(chǎn)成本。目前尚未有用畢赤酵母表面展示CALB全細(xì)胞催化劑催化合成肉桂醇酯的相關(guān)報(bào)道。本研究基于畢赤酵母表面展示技術(shù)，用表面展示CALB畢赤酵母全細(xì)胞為催化劑在無(wú)溶劑體系中催化合成肉桂醇酯，初步探討了Pp-CALB合成乙酸肉桂酯的最適反應(yīng)條件及操作穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

畢赤酵母重組菌株 GS115-pPIC9K-CALB-GCW（12+51+61），為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存[26,27]。其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

圖1 畢赤酵母表面展示脂肪酶CALB結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure schematic illustration of Pp-CALB whole-cell biocatalyst

Pp-CALB，指利用畢赤酵母(Pichia pastoris)壁蛋白GCW21，GCW51和GCW61作為錨定蛋白，將南極假絲酵母脂肪酶 B (Candida antarcticalipase B，CALB)展示在畢赤酵母細(xì)胞表面的一種全細(xì)胞生物催化劑。

1.1.2 培養(yǎng)基

無(wú)氨基酸酵母氮源YNB(Yeast nitrogen base)、蛋白胨(PEP)均購(gòu)自 Difco公司；酵母抽提物(YE)購(gòu)自O(shè)xford公司；YPD(Yeast extract peptone dextrose medium)、BMGY(Buffered glycerol-complex medium)、BMMY(Buffered methanol-complex medium)等培養(yǎng)基均按Invitrogen公司畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)配方配制。

1.1.3 試劑

肉桂醇、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、乙酸酐、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸異丙烯酯、乙酸丁酯均為分析純，無(wú)水乙醇(HPLC級(jí))，以上有機(jī)溶劑經(jīng)分子篩脫水處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 全細(xì)胞催化劑的制備

將畢赤酵母重組菌株 GS115-pPIC9K-CALBGCW（12+51+61）培養(yǎng)于YPD瓊脂固體平板上，24 h后接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h，以1%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h，然后在4 ℃、8000 r/min離心10 min得到菌體，轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)5 d，每隔24 h加入1%(V/V)甲醇誘導(dǎo)。然后收集發(fā)酵菌體，離心，用pH 8.0的Tris-Hcl緩沖液洗2次，最后用pH 8.0的Tris-Hcl緩沖液重懸，通過(guò)真空冷凍干燥得到催化劑干粉。

1.2.2 全細(xì)胞脂肪酶水解活力的測(cè)定

采用吸光度測(cè)定脂肪酶活力[28]。檢測(cè)全細(xì)胞催化劑干粉的酶活：用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)配置濃度為2 mmol/L的pNPB作為酶反應(yīng)底物，其中添加0.5%的Triton-X100。然后向0.5 mL的菌體重懸液中加入0.5 mL濃度為2 mmol/L的底物溶液，45 ℃下反應(yīng)一定時(shí)間，測(cè)定OD405值。每個(gè)樣品均測(cè)定3個(gè)平行樣，用未攜帶 CALB基因的重組畢赤酵母菌體GS115-pPIC9K-GCW（12+51+61）作空白對(duì)照。一個(gè)酶活力單位為每分鐘水解底物生成 1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量[29]，測(cè)得凍干粉水解酶活為 4032 U/(g·dry cell)。

1.2.3 全細(xì)胞催化劑合成肉桂醇酯

10 mL具塞錐形瓶中加入 12 mmol脂肪酸與 6 mmol肉桂醇，加入適量4?分子篩以去除反應(yīng)生成的水，放入恒溫?fù)u床中預(yù)熱30 min。加入一定量的全細(xì)胞催化劑，于恒溫?fù)u床中反應(yīng)3 h。在不同的反應(yīng)條件(搖床轉(zhuǎn)速、溫度、底物比例和酶加量等)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)束后離心取反應(yīng)液上清，-20 ℃保存待測(cè)。

1.2.4 反應(yīng)過(guò)程氣相色譜分析

采用Agilent7820A氣相色譜儀進(jìn)行反應(yīng)底物和產(chǎn)物定量分析，取反應(yīng)液10 μL，用無(wú)水乙醇稀釋至測(cè)定范圍，經(jīng)有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行分析，色譜條件如下：載氣為氮?dú)?；FID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度300 ℃，色譜柱HP-5，分流比40:1，柱箱溫度160 ℃，維持1 min，以30 ℃/min升溫至270 ℃，維持5 min。

1.2.5 酯化率的測(cè)定

利用外標(biāo)法計(jì)算肉桂醇含量，反應(yīng)酯化率由底物肉桂醇的消耗量來(lái)衡量。酯化率計(jì)算公式：

酯化率=[1-(W2/W1)]×100%

式中，W1，W2分別為酯化反應(yīng)前后體系中肉桂醇的含量(mmol)。

2 結(jié)果與討論

2.1 ?；w對(duì)Pp-CALB催化合成肉桂醇酯的影響

圖2 不同脂肪酸對(duì)Pp-CALB催化肉桂醇酯化反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of different aliphatic acids on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

向10 mL反應(yīng)瓶中加入6 mmol肉桂醇和12 mmol脂肪酸，以及0.05 gPp-CALB，在無(wú)溶劑體系中進(jìn)行肉桂醇酯的合成反應(yīng)，采用的脂肪酸分別為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸?？疾霵p-CALB對(duì)脂肪酸的選擇性，探討建立無(wú)溶劑反應(yīng)體系的可行性，在溫度50 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min下反應(yīng)3 h，結(jié)果如圖2所示。

由圖可看出，Pp-CALB對(duì)于含有支鏈的脂肪酸催化活性較低，這可能與CALB的催化結(jié)構(gòu)域大小有關(guān)[17]。乙酸和丙酸在無(wú)溶劑體系中的酯化率均很低，甲酸、丁酸、戊酸在無(wú)溶劑體系中的酯化率分別可達(dá)55.42%，63.50%，64.22%，可能是乙酸，丙酸極性較大，易形成親水性界面，奪取脂肪酶表面的必需水，破壞了蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，使部分酶失活[30]。

圖3 不同?；w對(duì)Pp-CALB催化肉桂醇酯化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of different acyl donors on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

乙酸肉桂酯是一種在工業(yè)生產(chǎn)中有較大需求的酯類(lèi)香料，以乙酸肉桂酯合成為例，比較乙酸、乙酸酐、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸異丙烯酯、乙酸丁酯幾類(lèi)常用?；w的作用效果，結(jié)果如圖 3所示。由圖可看出，以乙酸乙烯酯和乙酸異丙烯酯作為?；w時(shí)獲得的酯化率較高，由于乙酸異丙烯酯成本較高，故以下研究中選擇乙酸乙烯酯作為?；w。

2.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Pp-CALB催化肉桂醇轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Pp-CALB催化肉桂醇酯化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of agitation speed on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

搖床轉(zhuǎn)速影響著酶催化反應(yīng)的傳質(zhì)，傳熱以及底物同酶的接觸幾率。控制適合的轉(zhuǎn)速既能保證良好的傳質(zhì)傳熱，又可節(jié)約能耗。在無(wú)溶劑體系中考察了搖床轉(zhuǎn)速對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖可看出，隨著搖床轉(zhuǎn)速?gòu)?0 r/min增加到120 r/min，酯化率逐漸提高，因?yàn)闊o(wú)溶劑體系粘度較高，具有一定的傳質(zhì)阻力，提高轉(zhuǎn)速能夠有效增加底物與酶接觸的概率。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速再升高時(shí)，酯化率無(wú)明顯提升。故 120 r/min的轉(zhuǎn)速己經(jīng)可以滿足體系反應(yīng)要求。

2.3 溫度對(duì)Pp-CALB催化肉桂醇轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

圖5 溫度對(duì)Pp-CALB催化肉桂醇酯化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of temperature on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

從熱力學(xué)角度來(lái)說(shuō)，溫度的升高有利于提高轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的速率，酶促反應(yīng)溫度的高低對(duì)脂肪酶的分子構(gòu)象也有一定的影響，進(jìn)而影響酶的催化活性。反應(yīng)溫度對(duì)全細(xì)胞催化劑 Pp-CALB催化合成乙酸肉桂酯的影響見(jiàn)圖5，由圖可看出，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，該體系具有較高的酯化率，這是因?yàn)樵谳^低的溫度條件下，隨著溫度的升高，分子擴(kuò)散加速，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃的時(shí)候，達(dá)到最高酯化率，繼續(xù)升高反應(yīng)溫度酯化率下降，表明了 Pp-CALB在高溫下有一定的失活，因?yàn)楦邷厥堑鞍踪|(zhì)變性和失活的最常見(jiàn)的原因[31]。因此，50 ℃是Pp-CALB催化合成乙酸肉桂酯的最適溫度。

2.4 底物摩爾比對(duì)Pp-CALB催化肉桂醇轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

圖6 底物摩爾比對(duì)Pp-CALB催化肉桂醇酯化反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of molar ratio of substrate on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

反應(yīng)底物摩爾比對(duì)酶促反應(yīng)進(jìn)程影響較大，當(dāng)某一底物的濃度固定，反應(yīng)受底物摩爾比的影響十分顯著[25]，實(shí)驗(yàn)考察了不同底物摩爾比對(duì)肉桂醇酯化率的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖可知，隨著底物摩爾比（乙酸乙烯酯:肉桂醇）的增加，酯化率也在增加，當(dāng)?shù)孜锬柋葹?:1時(shí)，反應(yīng)酯化率達(dá)到74.11%，繼續(xù)增大底物摩爾比，酯化率逐漸降低，主要原因可能在于添加的乙酸乙烯酯過(guò)量，產(chǎn)生底物抑制效應(yīng)，以使得 Pp-CALB催化性能降低。同時(shí)過(guò)多的底物加入進(jìn)反應(yīng)體系，不利于反應(yīng)后期分離純化，并且造成多余的浪費(fèi)，故選擇底物摩爾比2:1較合適。

2.5 全細(xì)胞催化劑添加量對(duì)肉桂醇轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

圖7 不同Pp-CALB添加量對(duì)肉桂醇酯化反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of the amount of lipase on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

Pp-CALB的添加量對(duì)反應(yīng)速率和經(jīng)濟(jì)成本有著很大的影響，由圖7可知，隨著酶量增加，肉桂醇的酯化率提高，當(dāng)酶量由0.01 g增加到0.05 g時(shí)，酯化率穩(wěn)定提升；但酶量由0.05 g增加到0.08 g時(shí)，酯化率提升不明顯。原因可能是在底物濃度一定的條件下，當(dāng)酶量超過(guò)0.05 g后，由于底物濃度的限制，盡管酶量增加但酯化率不會(huì)顯著提高。此外在高酶濃度的催化體系中，催化劑很難維持均勻懸浮狀態(tài)，存在傳質(zhì)阻力[32]，而且，過(guò)量的酶加入反應(yīng)體系，會(huì)大大增加反應(yīng)成本，故在此反應(yīng)中0.05 g是比較合適的添加量。

2.6 初始水活度對(duì)全細(xì)胞催化劑合成肉桂醇酯的影響

非水相酶促反應(yīng)中, 脂肪酶需要一定量的結(jié)合水來(lái)維持其活性構(gòu)象的穩(wěn)定，只有達(dá)到最佳水含量的要求時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)剛性和熱力學(xué)穩(wěn)定性之間才能達(dá)到最佳平衡點(diǎn)[33]。本研究用飽和鹽預(yù)平衡的方法控制全細(xì)胞催化劑 Pp-CALB的初始水活度。在室溫下，將酶和底物在密閉容器中與飽和鹽溶液平衡 3 d，得到具有一定初始水活度的Pp-CALB和底物，所用的飽和鹽溶液包括：LiBr (aw=0.06)，LiCl (aw=0.11)，MgCl2(aw=0.33)，Mg (NO3)2(aw=0.53)，NaCl (aw=0.75)，K2SO4(aw=0.97)[34]。

圖8 不同水活度對(duì)Pp-CALB催化肉桂醇酯化反應(yīng)的影響Fig.8 Effect of different initial water activities on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

由圖8可知，使用Mg(NO3)2飽和溶液aw=0.53處理后的 Pp-CALB和底物，肉桂醇酯化率最高達(dá)81.34%。因此，Pp-CALB催化該反應(yīng)的最適水活度為0.53。

2.7 有機(jī)溶劑及無(wú)溶劑體系中肉桂醇酯合成結(jié)果比較

圖9 不同溶劑環(huán)境中的合成肉桂醇酯結(jié)果Fig.9 Effect of different reaction system on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

選擇乙酸乙烯酯為?；w，分別在有機(jī)溶劑及無(wú)溶劑體系中進(jìn)行乙酸肉桂酯的合成。底物摩爾比（乙酸乙烯酯:肉桂醇）為2，加入3 mL有機(jī)溶劑（正己烷、正庚烷、異辛烷），0.05 g全細(xì)胞催化劑，120 r/min，50 ℃反應(yīng)3 h，肉桂醇酯化效果如圖9所示。由圖可看出，在無(wú)溶劑體系中，肉桂醇的酯化率最高，故對(duì)于 Pp-CALB催化合成乙酸肉桂酯而言，無(wú)溶劑體系的酯化效果明顯優(yōu)于有機(jī)溶劑，這可能與無(wú)溶劑體系增大了底物的濃度有關(guān)，而且無(wú)溶劑體系比有機(jī)溶劑體系更具優(yōu)勢(shì)，可簡(jiǎn)化后續(xù)分離提純過(guò)程。

2.8 全細(xì)胞催化劑在肉桂醇轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中的操作穩(wěn)定性

圖10 全細(xì)胞催化劑Pp-CALB操作穩(wěn)定性Fig.10 Operational stability of the Pp-CALB

為達(dá)到降低生產(chǎn)成本的目的，本文研究了Pp-CALB的多次重復(fù)利用，每次反應(yīng)完成后，過(guò)濾Pp-CALB，然后用丙酮連續(xù)洗滌3～4次。最后將其放入干燥劑中，在室溫（30±2 ℃）中保存整夜，完全干燥后再次用于下一反應(yīng)[2]。由圖10可知，使用全細(xì)胞催化劑Pp-CALB連續(xù)反應(yīng)10個(gè)批次，第8批次反應(yīng)時(shí)，肉桂醇的酯化率仍能保持在70.00%以上，因此全細(xì)胞催化劑 Pp-CALB在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了良好的可重復(fù)使用性。

2.9 肉桂醇酯化反應(yīng)的進(jìn)程曲線

圖11 脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig.11 Time course of esterification catalyzed by Pp-CALB and Novozyme 435

綜合以上各單因素優(yōu)化的結(jié)果，在無(wú)溶劑反應(yīng)體系中，酶加量0.05 g（其中添加的Pp-CALB初始水活度為0.53），肉桂醇6 mmol，乙酸乙烯酯12 mmol，反應(yīng)溫度50 ℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，反應(yīng)3 h，在此條件下比較本實(shí)驗(yàn)室自制全細(xì)胞催化劑 Pp-CALB與Novozyme435對(duì)乙酸肉桂酯的催化效率。由圖11可知，Pp-CALB與Novozyme435合成乙酸肉桂酯有一定的差距，可能的原因是全細(xì)胞催化劑比酶活小，單位重量酵母細(xì)胞表面展示的CALB蛋白較少，而且單因素之間的交互作用沒(méi)有進(jìn)一步優(yōu)化，Pp-CALB合成乙酸肉桂酯的催化效率有進(jìn)一步提高的空間。

3 結(jié)論

3.1 本研究以畢赤酵母表面展示 CALB為全細(xì)胞催化劑，構(gòu)建了無(wú)溶劑體系中肉桂醇酯的綠色合成工藝。在底物摩爾比（乙酸乙烯酯:肉桂醇）為2:1，添加0.05 g初始水活度為 0.53的全細(xì)胞催化劑 Pp-CALB，50 ℃，120 r/min的條件下反應(yīng)3 h，肉桂醇酯化率可達(dá)81.34%。且該全細(xì)胞催化劑重復(fù)利用性好，連續(xù)反應(yīng)8次后，肉桂醇仍能達(dá)到較高的酯化率。

3.2 全細(xì)胞催化劑Pp-CALB不但具備固定化酶的特性，而且制作過(guò)程簡(jiǎn)單，有效節(jié)省了設(shè)備投資和運(yùn)行費(fèi)用。且構(gòu)建的無(wú)溶劑體系具有條件溫和，無(wú)溶劑揮發(fā)和產(chǎn)物更易提取等優(yōu)勢(shì)，是一條環(huán)境友好的酶法合成工藝路線，為優(yōu)質(zhì)香料的高效制備與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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