圣志存，吳雙，王安平，王米雪，朱善元

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實驗室，江蘇泰州 225300）

珊瑚菌(Ramaria botrytoides)，因外表形似珊瑚而名，又名掃帚菌、掃把菌、老鼠腳，隸屬于擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyporales)珊瑚菌科(Clavariaceae)，生于腐木上，分布于我國西南、華北和東北等地區(qū)，是我國野生食菌資源不可忽視的重要組成[1,2]?！兜崮媳静荨酚涊d珊瑚菌味甘，性平，無毒，主治和胃氣、祛風(fēng)、緩中等?，F(xiàn)代醫(yī)藥研究表明，珊瑚菌含有豐富的多糖、礦質(zhì)元素、氨基酸等對人體有益的生物活性物質(zhì)，具有補(bǔ)鈣、強(qiáng)勁壯骨、促進(jìn)肌體健康，提高肌體免疫力等作用[3,4]，常被人們煎煮藥用治療胃痛、宿食不化和風(fēng)痛等癥。

目前，珊瑚菌因其營養(yǎng)保健價值，對應(yīng)的研究受廣泛關(guān)注。李華等[5]對珊瑚菌子實體總萜的提取工藝進(jìn)行了深入研究；常正堯[6]等對珊瑚菌抗腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，其水煎劑對體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞株有明顯的抑制作用；而有關(guān)珊瑚菌液體培養(yǎng)，目前僅局限于其培養(yǎng)工藝和提取物的生物活性[7,8]，鮮見有關(guān)珊瑚菌子實體和液體培養(yǎng)菌絲體營養(yǎng)成分的全面研究報道。多糖，多羥基醛和多羥基酮通過糖苷鍵連接的高分子聚合物，是構(gòu)成生命四大基本物質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等諸多有益生物活性。多酚，作為植物的次級代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的自由基清除能力，且可以通過絡(luò)合過渡金屬離子和抑制氧化酶等起到抗氧化作用[9]。本文以珊瑚菌子實體和液體培養(yǎng)菌絲體為原料，比較分析了兩種不同來源珊瑚菌的營養(yǎng)成分與活性物質(zhì)多糖、多酚的含量及體外抗氧化活性，以期對珊瑚菌食藥價值的開發(fā)提供理論參考依據(jù)；此外，珊瑚菌液體培養(yǎng)研究將有助于解決其子實體生長周期長和自然資源稀少等問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珊瑚菌菌種由總后軍需裝備研究所郝利民教授鑒定饋贈，保藏于江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實驗室天然藥物研究室；珊瑚菌子實體，購自于云南省楚雄州姚安縣。

重蒸酚，福林酚試劑（分析純），北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美國Sigma公司；沒食子酸（分析純），天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（Vc）(分析純)，天津市科威有限公司；蛋白胨（BR），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鐵氰化鉀（化學(xué)純），硫酸、濃硝酸、高氯酸、鹽酸、氯化鐵均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T-500B高速多功能粉碎機(jī)，永康市哈瑞工貿(mào)有限公司；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器廠；BS-100A自動部分收集器，普陽科學(xué)儀器研究所；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；AA-6800原子吸收分光光度計，日本Shimadzu公司；L-8800氨基酸自動分析儀，日本Hitachi公司；722型分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備與處理

珊瑚菌菌絲體液體培養(yǎng)參照之前文獻(xiàn)報道[7]，培養(yǎng)結(jié)束，過濾得菌絲體。蒸餾水洗滌3遍，60 ℃烘干至恒重，機(jī)械粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，-20 ℃保藏待用。珊瑚菌子實體處理參考菌絲體，流水外表面沖洗干凈，烘干，粉碎過篩，過篩后烘干至恒重，待用。

1.3.2 一般營養(yǎng)成分分析

粗蛋白含量測定參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》[10]，凱氏定氮法測定總氮，粗蛋白質(zhì)含量=總氮含量×6.25；粗脂肪含量測定參照 GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》[11]；碳水化合物含量測定參照GB/Z 21922-2008《食品營養(yǎng)成分基本術(shù)語》[12]；灰分參照GB 5009.4-2010《食品中灰分的測定》[13]；能量（kJ/100 g干物質(zhì)）=碳水化合物×16.7+脂肪×37.7+蛋白×16.7[14]。

1.3.3 礦質(zhì)元素分析

精確稱取樣品 1.00 g置于凱氏瓶中，分別加入10.0 mL濃硝酸和2.0 mL高氯酸消解12 h后，加熱消煮，待反應(yīng)結(jié)束后，繼續(xù)煮沸至溶液變?yōu)闊o色透明，停止煮沸，冷卻至室溫，蒸餾水定容至50 mL，原子吸收分光光度計測定樣品元素含量。

1.3.4 氨基酸組成分析及評分

參照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》[15]。精確稱取0.25 g樣品放入特制玻璃水解管中，加入6 mol/L HCl 10 mL，抽真空，真空度達(dá)到要求后維持10 min，封口，110 ℃水解24 h，冷卻。濾紙過濾，取1 mL濾液60 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干。蒸干后樣品，加入5 mL的0.02 mol/L HCl，放置30 min后進(jìn)行測定。

氨基酸評分（AAS）根據(jù)世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（WHO/FAO）建議的標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行評價：

1.3.5 多糖提取與含量測定

珊瑚菌多糖提取采用水提醇沉法，提取工藝參照文獻(xiàn)[16]：料液比1:30（m/V）、提取溫度90 ℃、提取時間60 min。提取結(jié)束抽濾，真空減壓濃縮，4倍體積的95%乙醇4 ℃醇沉過夜，離心收集沉淀，沉淀蒸餾水復(fù)溶后進(jìn)行離子交換柱層析。吸光度490 nm苯酚硫酸法檢測多糖，收集各部分多糖，濃縮，冷凍干燥得多糖樣品。多糖含量測定苯酚硫酸法[17]。

1.3.6 多酚提取與含量測定

多酚提取采用乙醇回流法，提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1:30（m/V）、提取溫度50 ℃、提取時間 20 min。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalteu比色法[18]測定多酚的含量。

1.3.7 抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力測定

參考 Shimada等[19]方法并改進(jìn)。不同濃度樣品(0.1~1 mg/mL) 0.5 mL與1.5 mL的0.15 mmol/L DPPH甲醇溶液混合，搖勻，避光37 ℃水浴30 min，于517 nm波長處測定吸光度。以相同濃度Vc作為陽性對照，蒸餾水作為空白對照。

式中：A0為空白組吸光度，A1為不同濃度樣品組吸光度。

1.3.7.2 還原力測定

還原力測定參照Oyaizu[20]等的方法，采用鐵氰化鉀還原法測定。

式中：A0為樣品組吸光度，A1為樣品本底吸光度值（蒸餾水代替FeCl3溶液）。相同濃度的Vc作為陽性對照。

不同濃度樣品溶液（0.1~1 mg/mL）2.5 mL，pH 6.6磷酸緩沖液（0.2 mol/L）2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻，50 ℃反應(yīng)20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，5000 r/min離心10 min，取上清液5 mL 和0.1% FeCl32.5 mL，混勻，靜置10 min，700 nm處測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本文所有測定結(jié)果均重復(fù)3次，以±s表示；采用 SPSS 17.0ANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，以p<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 基本營養(yǎng)成分測定

由表1可知，珊瑚菌菌絲體蛋白、脂肪、碳水化合物含量分別為22.30%、3.21%、63.55%，均高于其子實體含量（11.02%、2.52%、38.74%），其中子實體蛋白含量低于參比組香菇子實體（20.3%）和云芝菌絲體（43.1%），菌絲體蛋白含量高于香菇子實體，低于云芝菌絲體。人體內(nèi)碳水化合物主要為多糖類物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化等生物活性[21]，比較碳水化合物含量，珊瑚菌菌絲體含量（63.55%）均高于其子實體（38.74%）和參比組。

綜合上述基本營養(yǎng)指標(biāo)，其結(jié)果可能預(yù)示珊瑚菌菌絲體營養(yǎng)價值高于其子實體。比較珊瑚菌子實體和菌絲體灰分含量，兩者基本接近，統(tǒng)計分析無顯著差異（p>0.05）。

表1 珊瑚菌子實體與菌絲體基本營養(yǎng)成分分析Table 1 Analysis of the basic nutrient components in fruit body and mycelium from Ramaria botrytoides

表2 珊瑚菌子實體與菌絲體礦質(zhì)元素分析Table 2 Analysis of mineral elements in fruit body and mycelium from Ramaria botrytoides

2.2 礦質(zhì)元素含量測定

由表2可知，珊瑚菌子實體礦質(zhì)元素Ca、Cu、Mn含量均顯著高于其菌絲體含量（p<0.05）。Mg含量，菌絲體顯著高于其子實體含量（p<0.05），這可能是由于菌絲體液體培養(yǎng)過程中吸收培養(yǎng)基中的Mg2+。統(tǒng)計分析二者Fe，Zn含量無顯著差異（p>0.05），基本接近。此外，珊瑚菌子實體和菌絲體中 Cr、Pb的含量未超過國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（Cr<1.0 mg/kg，Pb<0.5 mg/kg）[24]，菌絲體Cr、Pb含量均遠(yuǎn)超過其的子實體，這是由于菌絲體培養(yǎng)過程中存在重金屬的富集特性[25]。

2.3 氨基酸含量測定與評價

表3 珊瑚菌子實體與菌絲體氨基酸成分分析Table 3 Analysis of amino acids composition in fruit body and mycelium from Ramaria botrytoides

由表3可知，珊瑚菌子實體和菌絲體樣品中均含有7種必須氨基酸和10種非必需氨基酸。氨基酸總量，菌絲體與子實體分別為21.36±0.79和9.27±0.36 g/100 g，其中菌絲體含量是子實體的2.3倍。必須氨基酸含量，菌絲體和子實體分別為 7.08±0.15和 2.55±0.24 g/100 g，分別占氨基酸總量的33.14%和27.50%，均低于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)（35.38%）。蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值主要取決于必須氨基酸的種類和含量[26]。依據(jù)WHO/FAO理想蛋白質(zhì)中必須氨基酸含量的建議模式和評分標(biāo)準(zhǔn)，對珊瑚菌子實體和菌絲體進(jìn)行營養(yǎng)評價。結(jié)果如表4所示，珊瑚菌菌絲體必須氨基酸AAS評分均普遍高于子實體，Val除外；對于珊瑚菌子實體，其限制性氨基酸為Lys；菌絲體限制性氨基酸為Val。綜合氨基酸含量與必須氨基酸評價結(jié)果，珊瑚菌菌絲體氨基酸營養(yǎng)價值高于其子實體，這可能是菌絲體培養(yǎng)營養(yǎng)吸收過程培養(yǎng)基蛋白胨含有豐富氨基酸來源。

2.4 多糖、多酚含量測定

圖1 珊瑚菌子實體與菌絲體中多糖、多酚含量Fig.1 Content of polysaccharides and polyphenols in fruit body and mycelium from Ramaria botrytoides

已有研究表明生物物質(zhì)中酚類、糖類化合物的含量高低決定其抗氧化能力的強(qiáng)弱[27,28]。如圖1所示，測定珊瑚菌子實體多糖含量為23.22±1.60 mg/g，多酚含量為6.85±0.41 mg/g；菌絲體多糖含量為35.51±1.78 mg/g，多酚含量為3.66±0.29 mg/g。子實體多糖含量顯著低于其菌絲體，多酚含量顯著高于其菌絲體（p<0.05），這可能是由于菌絲體培養(yǎng)基中含足量合成多糖的前體物質(zhì)蔗糖，易于多糖的合成；而多酚作為植物細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物，是形成植物顏色、苦澀口感、氣味等一類重要化合物，具有強(qiáng)抗氧化能力[29]，與菌絲體相比，珊瑚菌子實體具備野外環(huán)境優(yōu)勢，多酚有助于抵抗野外氧化脅迫[30]，因此含量高于菌絲體。

表4 珊瑚菌子實體與菌絲體必需氨基酸AAS評價結(jié)果Table 4 AAS evaluation analysis of essential amino acids in fruit body and mycelium from Ramaria botrytoides

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH法測定珊瑚菌多糖、多酚抗氧化活性

圖2 珊瑚菌子實體和菌絲體多糖、多酚DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging ability of polysaccharides and polyphenols in fruit body and mycelium from Ramaria botrytoides

由圖2可知，珊瑚菌菌絲體與子實體多糖、多酚含量對DPPH自由基清除率呈劑量依賴型，且菌絲體多糖清除能力強(qiáng)于其子實體，子實體多酚清除能力強(qiáng)于其菌絲體。對于珊瑚菌多糖，菌絲體和子實體樣品濃度均與清除率呈線性正相關(guān)，分別為Y=67.04X+9.728（R2=0.935）， Y=50.78X+4.323（R2=0.965），其中Y代表清除率（%），X代表樣品濃度（mg/mL）；因此計算菌絲體和子實體多糖 EC50值計算分別為0.60，0.89 mg/mL。對于珊瑚菌多酚，子實體多酚清除DPPH能力大于所有樣品組，接近于Vc對照組；菌絲體多酚當(dāng)濃度大于0.6 mg/mL時，其清除能力達(dá)到平衡穩(wěn)定值，超過80%，接近Vc；0~0.6 mg/mL時，呈線性關(guān)系（Y=131.2X+2.892，R2=0.991），計算得其EC50為0.36 mg/mL。

2.5.2 還原力法測定珊瑚菌多糖、多酚抗氧化活性

圖3 珊瑚菌子實體和菌絲體多糖、多酚還原能力Fig.3 Reducing ability of polysaccharides and polyphenols in fruit body and mycelium from Ramaria botrytoides

還原力作為抗氧化活性評價重要指標(biāo)，抗氧化劑能與Fe3+發(fā)生氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在700 nm波長處有最大吸收值[31]。吸光度越高還原力越強(qiáng)，表明抗氧化活性越高。由圖3可知，珊瑚菌菌絲體多糖、多酚、子實體多糖含量與還原力成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.994、0.980和0.998；子實體多酚濃度大于0.4 mg/mL時，還原力抗氧化指標(biāo)接近 Vc；四種樣品還原力抗氧化強(qiáng)弱依次為子實體多酚>菌絲體多酚>菌絲體多糖>子實體多糖，其結(jié)果與清除DPPH自由基一致。因此，對于不同來源（菌絲體、子實體）珊瑚菌而言，多酚抗氧化活性均大于多糖；子實體多酚抗氧化活性大于其菌絲體，菌絲體多糖活性大于其子實體。結(jié)合菌絲體與子實體多糖含量測定結(jié)果，對于珊瑚菌多糖，采用液體培養(yǎng)制備多糖有望取代傳統(tǒng)子實體提取，解決珊瑚菌野生資源稀缺等問題；對于珊瑚菌多酚，因液體培養(yǎng)不具備野外自然環(huán)境等優(yōu)勢，多酚含量包括其抗氧化活性，菌絲體都低于其子實體。

3 結(jié)論

3.1 比較分析珊瑚菌子實體和菌絲體營養(yǎng)成分，菌絲體碳水化合物、脂肪、蛋白、灰分含量分別為63.55%、3.21%、22.30%、5.98%，子實體 38.74%、2.52%、11.02%、5.77%，菌絲體營養(yǎng)成分質(zhì)量高于子實體。礦質(zhì)元素Ca、Cu、Mn，子實體含量高于菌絲體；Mg元素，菌絲體高于其子實體；Fe、Zn含量接近。氨基酸含量，菌絲體氨基酸總量為21.36±0.79 mg/100 g，必須氨基酸含量占 33.14%；子實體氨基酸總量為9.27±0.36 mg/100 g，必須氨基酸含量占27.50%。

3.2 比較分析多糖、多酚含量及其抗氧化活性，子實體多酚 6.85±0.41 mg/g含量高于菌絲體 3.66±0.29 mg/g，菌絲體多糖 35.51±1.78 mg/g含量高于子實體23.22±1.60 mg/g。DPPH自由基清除能力和還原力抗氧化強(qiáng)弱依次為子實體多酚>菌絲體多酚>菌絲體多糖>子實體多糖。結(jié)合前面營養(yǎng)成分分析結(jié)果可知，珊瑚菌菌絲體營養(yǎng)豐富，具有極高價值。而且，珊瑚菌菌絲體多糖含量與活性均高于子實體，因此對于多糖型藥膳保健原料，有望替代子實體緩解野生資源的不足；而多酚，其菌絲體含量活性結(jié)果弱于珊瑚菌子實體，仍有待進(jìn)一步挖掘利用。

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