石揚(yáng)，張永進(jìn)，賴年悅，林琳，姜紹通，陸劍鋒

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽合肥 230009）（2.合肥市畜牧水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，安徽合肥 231000）

眾所周知，在世界范圍內(nèi)，癌癥（“惡性腫瘤”）已成為首要死因之一，約占所有死亡人數(shù)的 1/8，并顯著影響人口的變化[1]。盡管近年來化療藥物在治療癌癥方面取得了較大進(jìn)展，但依舊存在很多問題。據(jù)澳洲一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[2]，治療性和輔助性細(xì)胞毒性化療對(duì)成人 5年生存率的總體貢獻(xiàn)在澳大利亞為2.3%，在美國(guó)僅為2.1%。因此，根據(jù)一些新型作用機(jī)制研發(fā)新型高效抗癌藥物將成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，而生物活性肽（Biologically active peptides，BAP）抗癌活性尤為突出，且在很大程度上優(yōu)于傳統(tǒng)的化療藥物，對(duì)于解決傳統(tǒng)化療藥物的弊端具有重要的意義[3]。生物活性肽本身是一類由母蛋白通過酶水解、腸道消化或食品加工而釋放出來的具有生理和激素調(diào)節(jié)作用的多功能肽[4]。研究表明，通過酶解蛋白獲得的生物活性肽具有抗菌、抗氧化、抗增殖和抗誘變等活性，正是這些活性使得其具有抗癌潛能[5]。隨著研究手段和方法的不斷提高以及蛋白質(zhì)工程和酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是免疫活性肽與抗癌活性肽研究的不斷深入，未來生物活性肽的開發(fā)和利用將具有廣闊前景[6]。

中華草龜（Chinemys reevesiis）又名烏龜，草龜，泥龜?shù)?，屬龜鱉目（Testudinate）龜科（Emydidae）烏龜屬（Chinemys），生活在淡水水域，分布于全國(guó)各地。中華草龜既是一種美味可口和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的珍貴佳肴，又是一種具有重要醫(yī)療價(jià)值的藥物[7]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，中華草龜對(duì)癌癥具有輔助治療效果[8]，但這一效果至今尚未得到科學(xué)證實(shí)，有待進(jìn)一步研究。近年來，國(guó)內(nèi)對(duì)龜類抗腫瘤的研究一直處于匍匐前行狀態(tài)，目前僅有從金錢龜（Cuora trifasciata）中提取抗腫瘤肽的報(bào)道[9]，因此從中華草龜中提取抗腫瘤活性肽對(duì)龜類在抗癌領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。

在前期的研究中，我們利用單因素和正交試驗(yàn)法獲得了酶法提取中華草龜抗腫瘤粗提肽的最佳條件[10]。本文進(jìn)一步采用分離純化和活性檢測(cè)相結(jié)合的方法對(duì)該粗提肽的有效成分進(jìn)行篩選，最終得到組分較單一的抗癌活性肽。該研究可為抗癌先導(dǎo)藥物的研發(fā)以及中華草龜?shù)纳罴庸ぬ峁├碚摶A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中華草龜龜肉的抗腫瘤活性肽酶解產(chǎn)物凍干粉，自制[10]。制作方法：稱取一定量的龜肉，勻漿后用木瓜蛋白酶酶解，酶解時(shí)間8 h，pH 7.5，溫度60 ℃，加酶量0.5%（4000 U/g），料液比3:1。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶6 min，冷卻后過濾，濾液在8000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液冷凍干燥成粉末備用。

1.2 主要試劑

胎牛血清（優(yōu)級(jí)純），美國(guó) Hyclone公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶，美國(guó)Sigma公司；青霉素-鏈霉素，美國(guó)Gibco公司；MTT，美國(guó)Sigma公司；DMSO，美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國(guó)Costar公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó) Costar公司；Sephadex G-75、Sephadex G-50、Sephadex LH-60，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；TRIS，北京索萊寶科技有限公司；一級(jí)色譜純乙腈，四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；三氟乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純（AR）。

1.3 癌（腫瘤）細(xì)胞株

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和小鼠成纖維細(xì)胞L929，均購(gòu)自中科院上海生化細(xì)胞所。

1.4 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Varioscan Flash酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；VTGD1312細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Shell Lab公司；ZHJH-C1112C型超凈工作臺(tái)，上海博通化學(xué)科技有限公司；FD-1B-50冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康儀器有限公司；CT15RT冷凍離心機(jī)，上海天美；8400超濾杯/10000 u超濾膜，美國(guó)Millipore公司；YC-2層析實(shí)驗(yàn)冷柜，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Φ 3.2×75 cm層析柱，上海琪特分析儀器有限公司；CBS-C多功能全自動(dòng)部分收集器，上海滬西；BT-200B數(shù)顯恒流泵，上海滬西；Φ 4.6×250 mm Symmetry C18反相色譜柱，美國(guó)Waters公司；2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Nicolet公司；J-810圓二色光譜儀，日本Jasco公司；液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；L-8900氨基酸全自動(dòng)分析儀，日本HITACHI公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法與內(nèi)容

1.5.1 細(xì)胞毒性檢測(cè)

制備MCF-7細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔180 μL，置5% CO2、37 ℃貼壁培養(yǎng)24 h；隨后加入相應(yīng)濃度的中華草龜抗癌成分（同時(shí)設(shè)立PBS對(duì)照組）繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入5% MTT 20 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO充分振蕩10 min；最后置酶標(biāo)儀上，在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度A值，按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，即IR%=(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/OD對(duì)照×100%[10]。

1.5.2 酶解液超濾分級(jí)

本實(shí)驗(yàn)采用截留分子量為10 ku的超濾膜進(jìn)行超濾。在常溫下，以氮?dú)猓∟2）為加壓氣體，設(shè)定0.2 MPa（表壓）壓力進(jìn)行操作，分離后收集對(duì)應(yīng)組分的濾液，冷凍干燥后通過細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（即 MTT法）分別測(cè)定其對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

1.5.3 氨基酸總含量檢測(cè)

根據(jù)細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，超濾組分在 10 ku以下部分有較高的細(xì)胞毒性，所以選擇龜肉、龜肉酶解液和10 ku以下超濾組分的凍干樣品進(jìn)行氨基酸組成及對(duì)應(yīng)各種氨基酸含量百分比的檢測(cè)分析，并進(jìn)行相互比較。具體操作方法為：精確稱取樣品0.01 g，溶于蒸餾水，并定容至100 mL；取1 mL置安瓿瓶中，加2 mL 6 mol/L HCl（色氨酸Trp未測(cè)定）后充滿氮?dú)猓诰凭珖姛粝驴焖倜芊?，并放?10 ℃烘箱中水解24 h；水解完全冷卻后，在70 ℃水浴鍋中揮發(fā)鹽酸，雙蒸水洗滌2～3次，并蒸干；用適量pH 2.20的緩沖液溶解定容；最后用0.22 μm微孔濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)[11]。

1.5.4 葡聚糖凝膠柱層析

采用Sephadex G-75，Sephadex G-50和Sephadex LH-60柱對(duì)龜肉酶解液進(jìn)行分離純化。Sephadex G-75和Sephadex G-50柱的條件是：采用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速0.8 mL/min，上樣量為10 mL（約含500 mg蛋白樣品）；Sephadex LH-60柱的條件是：洗脫液為甲醇/水混合溶液，并采用梯度洗脫（甲醇含量從10%逐漸升高至100%沖柱）。自動(dòng)收集器每管收集時(shí)間4 min，收集體積3.2 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，自動(dòng)收集器配置Collection version 2.5版本的核酸蛋白檢測(cè)系統(tǒng)軟件，收集數(shù)據(jù)后進(jìn)行蛋白圖譜分析。

1.5.5 反相高效液相色譜

采用Symmetry Shield RP C185 μm柱，洗脫液A為100%雙蒸水（含0.1% TFA），洗脫液B為100%乙腈(含0.1%TFA)，洗脫條件為：0～5 min，0% B；5～20 min，30% B；20～30 min，70% B；30～35 min，0% B。洗脫液流速：2 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，柱溫30 ℃。樣品上樣量為50 μL，上樣前用0.22 μm微孔濾膜過濾[12]。

1.5.6 紫外掃描吸收?qǐng)D譜

將純化以后的多肽組分配制成濃度為 0.10 mg/mL樣品，用酶標(biāo)儀在200～380 nm波長(zhǎng)掃描紫外吸收波譜。

1.5.7 紅外圖譜

對(duì)經(jīng)初步分離純化得到的多肽組分，與一定量的KBr混合后置于瑪瑙研缽內(nèi)研磨成細(xì)微粉末，裝樣手動(dòng)壓片，用傅里葉變換紅外掃描儀在 4000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.5.8 圓二色圖譜

多肽樣品配制成0.20 mg/mL溶液，取450 μL溶液將光徑為1 mm的比色皿充滿，設(shè)定掃描速率100 nm/min，掃描180～280 nm的圓二色譜圖。

1.5.9 主成分多肽分子量測(cè)定

對(duì)TP-1組分中的主成分多肽進(jìn)行分子量測(cè)定。經(jīng)UPLC分析后的樣品流穿過電噴霧界面進(jìn)入質(zhì)譜儀，霧化氣和干燥氣均為高純氮?dú)?，采用正離子掃描模式，在質(zhì)/核比（m/z）350～1800范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[13]，最終獲得主成分多肽分子量。

1.5.10 活性肽IC50值

經(jīng)過Sephadex LH-60純化得到三個(gè)多肽組分，分別對(duì)其進(jìn)行乳腺癌MCF-7癌細(xì)胞的毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考察活性肽對(duì)正常小鼠成纖維細(xì)胞 L929的毒性作用，最后計(jì)算活性最好組分峰Ⅰ的IC50值及其對(duì)時(shí)間（選擇濃度1 mg/mL）和濃度的依賴性。

1.5.11 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2007，圖表的繪制采用Excel 2007以及OriginPro 8.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸檢測(cè)結(jié)果及分析

通常情況下，小肽類分子的氨基酸組成及一定量的螺旋或折疊直接決定了活性肽的生理功能，如抗氧化活性肽和 ACE抑制活性肽等[14]。在這些小肽分子中，少數(shù)幾個(gè)氨基酸出現(xiàn)的幾率要遠(yuǎn)高于其余氨基酸。

表1 不同處理樣品中氨基酸含量變化（%）Table 1 Changes of amino acid content in different treated samples (%)

由表1可知，中華草龜龜肉經(jīng)酶解、超濾，并凍干后，大部分氨基酸占總氨基酸比例呈現(xiàn)出較大的變化。但總體上來說，具備以下特點(diǎn)：亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）、賴氨酸（Lys）、丙氨酸（Ala）、異亮氨酸（Ile）、纈氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）等七種氨基酸含量遠(yuǎn)高于其余氨基酸，氮端（N-）氨基酸序列中，甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Cys）出現(xiàn)頻率較高，碳端（C-）序列中，賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）出現(xiàn)頻率較高，該結(jié)果符合Tyagi[15]報(bào)道的抑癌抑菌活性多肽的特點(diǎn)。

那些對(duì)抗腫瘤活性肽的生物活性有重要影響的氨基酸種類（標(biāo)★），其含量百分比均位于前列，這在一定程度上提示了龜肉蛋白有潛在的抗腫瘤作用。此外，三種樣品中的谷氨酸含量均為最高，且通過酶解及超濾處理可使樣品中的疏水性氨基酸比例趨于增加。根據(jù)Chalamaiah等[16]的研究結(jié)論，抗癌肽的疏水性氨基酸含量一般較高，而且?guī)щ姲被幔ㄈ绻劝彼幔?duì)活性肽抗癌性質(zhì)的形成有重要作用，其含量通常也較高。由此可見，酶解和超濾處理對(duì)后續(xù)抗癌肽的獲得和篩選具有重要的意義。

2.2 柱層析純化結(jié)果

根據(jù)抗癌活性檢測(cè)結(jié)果，超濾組分在10 ku以下的部分有較高的細(xì)胞毒活性，因此選擇分子量小于10 ku的組分進(jìn)一步進(jìn)行分離純化，依次采用G-75葡聚糖層析、G-50葡聚糖層析、羥丙基葡聚糖凝Sephadex LH-60層析篩選抗癌較單一組分，分離過程中采用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)抗癌組分進(jìn)行追蹤。

圖1 酶解液的凝膠層析圖譜及各組分抗癌效果Fig.1 Sephadex chromatograms of the enzymatic hydrolysates and anticancer effects of each component

本研究根據(jù)多肽分子大小和極性對(duì)樣品進(jìn)行分離純化。在多肽的分離純化過程中，采用多種技術(shù)聯(lián)用，不僅可以揚(yáng)長(zhǎng)避短，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，節(jié)約時(shí)間，而且可提高分離的效果和精確度[17]。

由圖1可知，酶解液10 ku以下組分經(jīng)過Sephadex G-75柱圖譜分離得到兩個(gè)峰，命名為峰A和峰B；細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示峰 A對(duì) MCF-7抑制率較高（53.57%），所以選擇峰A組分過Sephadex G-50柱，又分離出兩個(gè)峰，命名為峰a和峰b；細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示峰b對(duì)MCF-7抑制率較高（55.26%），因此選擇峰b組分過Sephadex LH-60柱，進(jìn)行梯度洗脫，最終分離得到三個(gè)峰，依次命名為峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ，且各峰區(qū)分程度明顯，分離效果良好；細(xì)胞毒性追蹤結(jié)果顯示峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ組分對(duì)正常小鼠成纖維細(xì)胞L929的毒性均較小，但對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的毒性均較大，其中峰Ⅰ顯示出了最強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其最大抑制率（IR%）可達(dá)80%以上，將該組分命名為TP-1（tortoise peptide-1）。

從細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著不同分離純化步驟的依次進(jìn)行，所得活性組分的抑癌效果逐漸增強(qiáng)，表明酶解粗提物中的抗癌活性組分得到了充分提取，同時(shí)也表明本研究所選的分離純化手段是科學(xué)可行的。

2.3 活性組分紫外、紅外、圓二色譜表征

對(duì)TP-1組分進(jìn)行紫外吸收全波長(zhǎng)掃描、紅外掃描和圓二色譜表征，其結(jié)果分別見圖2、3和4所示。

圖2 TP-1組分紫外吸收?qǐng)D譜Fig.2 UV spectrum of the bioactive peptide TP-1

圖3 TP-1組分紅外吸收?qǐng)D譜Fig.3 FT-IR spectrum of the bioactive peptide TP-1

圖4 TP-1組分圓二色譜圖Fig.4 CD spectrum of the bioactive peptide TP-1

由圖2可知，該組分在220～280 nm表現(xiàn)出肽鍵的強(qiáng)吸收，表明產(chǎn)物中存在芳香族氨基酸，這也是典型的蛋白質(zhì)和多肽的特征吸收[18]。

由圖3可知，在1650～1230 cm-1處的吸收峰為酰胺鍵的特征吸收，3276～3400 cm-1處的吸收峰可能是O-H和N-H的伸縮振動(dòng)，673 cm-1和1061 cm-1可能是-NH2的吸收，在2986 cm-1處的吸收可能是-CH3的伸縮振動(dòng)，而酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶通常是由α-螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的疊加共同作用所產(chǎn)生的吸收帶，蛋白分子氨基酸之間含有大量肽鍵，且由于羰基鍵的伸縮振動(dòng)，導(dǎo)致了酰胺Ⅰ帶的特征吸收峰通常位于1600～1700 cm-1處[19]。圖中1650 cm-1附近處有C=O伸縮振動(dòng)（酰胺Ⅰ），此振動(dòng)可形成無(wú)規(guī)則卷曲；多肽結(jié)構(gòu)中酰胺Ⅲ帶的特征吸收通常位于 1340～1220 cm-1，圖中1241 cm-1、1230 cm-1處的吸收表明，該多肽結(jié)構(gòu)中的酰胺Ⅲ帶有β折疊的存在。紅外圖譜結(jié)果為精確分析多肽結(jié)構(gòu)提供了一定的參考價(jià)值，結(jié)合后續(xù)的質(zhì)譜技術(shù)可基本確定多肽化學(xué)結(jié)構(gòu)[20,21]。

Greenfield[22]在利用圓二色譜對(duì)蛋白質(zhì)和多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中總結(jié)出了不同二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲）所對(duì)應(yīng)的典型特征吸收譜圖，β-轉(zhuǎn)角在180～190 nm范圍內(nèi)會(huì)呈現(xiàn)負(fù)峰，無(wú)規(guī)則卷曲一般會(huì)在200 nm呈明顯負(fù)峰，結(jié)合圖4及Greenfield的結(jié)論，提示了TP-1組分中β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象結(jié)構(gòu)含量較高[23]，該結(jié)果和前面紅外光譜分析得出的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)論相吻合。綜合考慮，該活性肽可能同時(shí)存在β-轉(zhuǎn)角，β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，然而正是這些二級(jí)結(jié)構(gòu)共同決定了該多肽組分的生物活性[24]。

2.4 RP-HPLC圖譜

RP-HPLC分析結(jié)果如圖5所示，在保留時(shí)間約為10 min時(shí)得到TP-1組分的主要多肽成分，其含量明顯高于其他多肽含量，且由圖5也可以看出，該組分中雜質(zhì)成分極少，純度較高。

圖5 TP-1活性肽組分RP-HPLCFig.5 RP-HPLC spectrum of the bioactive peptide TP-1

2.5 質(zhì)譜法對(duì)主成分多肽分子量測(cè)定

圖6 TP-1活性肽組分測(cè)序質(zhì)譜圖Fig.6 MS spectrum of the bioactive peptide TP-1

收集TP-1組分，采用UPLC串聯(lián)NSI噴霧質(zhì)譜儀進(jìn)行分子量測(cè)定。質(zhì)譜儀自動(dòng)對(duì)來自UPLC的洗脫組分交替進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜（MS）和二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）處理，借助分析軟件和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，可對(duì)各組分進(jìn)行分子量測(cè)定[25]。質(zhì)譜結(jié)果如圖6所示，結(jié)果顯示MH+為1411.7 u，經(jīng)計(jì)算得出該組分（TP-1）中主成分多肽分子量約為1410.7 u，其屬于低分子量短肽。通常，低分子量肽易于消化吸收且具備較多生理功能，如抗癌作用[16]。目前，從水生生物中已提取出來少量抗癌肽，如Hsu等[26]從金槍魚的暗色肌中提取出了分子量分別為1206 u和1124 u的兩種短肽，其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有較強(qiáng)的抑制作用；Sheih等[27]從藻類中提取出了分子量為 1309 u的短肽，其對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS有較強(qiáng)的抑制作用。以上抗癌肽均屬低分子量短肽，且與本文主成分多肽分子量相近。此外，結(jié)合本文前面的氨基酸分析結(jié)果，所得多肽極具抗癌肽的特征，該結(jié)論為細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了一定的理論依據(jù)。

2.6 細(xì)胞毒性及IC50值

對(duì) TP-1進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，以其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長(zhǎng)抑制率作為指標(biāo)，進(jìn)行劑量依耐性與時(shí)間依耐性檢測(cè)，所得結(jié)果如下。

圖7 TP-1組分細(xì)胞毒性的濃度依賴性Fig.7 Concentration dependence of cytotoxicity of the bioactive peptide TP-1

圖8 TP-1組分細(xì)胞毒性的時(shí)間依賴性Fig.8 Time dependence of cytotoxicity of the bioactive peptide TP-1

由圖7和圖8可知，TP-1組分具有明顯的藥物濃度依賴性和時(shí)間梯度依賴性。以95%為置信度，對(duì)濃度依賴性曲線進(jìn)行線性回歸得到其線性關(guān)系方程為y=4.1195x+39.03369，R2=0.96832＞0.707，擬合度較好。計(jì)算IC50值約為2.7 mg/mL。由于該組分對(duì)正常細(xì)胞的毒性均較小，符合藥物先導(dǎo)物要求[28]，有一定開發(fā)潛力。

3 結(jié)論

氨基酸含量的分析表明，中華草龜龜肉及其酶解物中含有豐富的活性氨基酸，這些氨基酸是抗腫瘤活性肽所必需的氨基酸，且經(jīng)過連續(xù)葡聚糖凝膠柱層析后，最終得到一個(gè)活性較強(qiáng)的組分TP-1，其IC50值約為2.7 mg/mL，且對(duì)正常細(xì)胞毒性極小。

RP-HPLC譜圖的結(jié)果表明，該組分純度較高。最后經(jīng)LC-MS/MS分析測(cè)得TP-1組分中主成分多肽分子量約為1410.7 u，該多肽成分的研究為后續(xù)進(jìn)一步結(jié)合生物技術(shù)或生物工程手段進(jìn)行抗癌先導(dǎo)藥物合成奠定了基礎(chǔ)。

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