李　潔，程筱雯，汪　波，徐元宏

冠心病是由冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、低氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，嚴(yán)重危害著人類健康。氯吡格雷及阿司匹林聯(lián)合進(jìn)行雙重抗血小板治療已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)，能明顯降低術(shù)后不良心血管事件發(fā)生率及支架內(nèi)血栓形成的風(fēng)險[1]。但在臨床應(yīng)用及實踐中顯示，氯吡格雷對冠心病人群的抗血小板作用存在個體差異，部分患者對氯吡格雷的抗血小板作用出現(xiàn)低反應(yīng)甚至毫無應(yīng)答，此種現(xiàn)象被稱為氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)[2-3]。目前證實CYP2C19的基因多態(tài)性是CR最重要的內(nèi)部影響因素[4]。CYP2C19是細(xì)胞色素P450氧化酶(cytochrome P450 oxidases，CYP450)第二亞家族的重要成員，作為一種重要的藥物代謝酶，參與多種藥物的體內(nèi)代謝，其中包括氯吡格雷、奧美拉唑、苯妥英及丙戊酸等[5]。CYP2C19酶由于遺傳多態(tài)性，不同個體間酶活性存在顯著不同。通過該酶代謝的氯吡格雷等藥物隨著患者基因型的不同，其療效和副作用也明顯不同[6-7]。通過檢測患者代謝速度類型，合理調(diào)整用藥劑量，是提高經(jīng)CYP2C19酶代謝的藥物的療效，減少毒副作用的有效途徑。該研究擬采用DNA微陣列芯片法對244例安徽地區(qū)漢族冠心病患者的CYP2C19基因多態(tài)性分布特點進(jìn)行分析，同時與不同地區(qū)漢族人群，各少數(shù)民族之間的CYP2C19基因多態(tài)性進(jìn)行比較，以期為冠心病人群個體化用藥提供參考。

1　材料與方法

1.1病例資料世界衛(wèi)生組織將冠心病分為5大類：無癥狀心肌缺血(隱匿性冠心病)、心絞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭(缺血性心臟病)和猝死5種臨床類型。臨床中常常分為穩(wěn)定性冠心病和急性冠狀動脈綜合征。基于以上范圍選取2017年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的244例安徽地區(qū)患者。所有患者為漢族，男146例，女98例；年齡41～84(64.3 ±10.4)歲。

1.2主要儀器和試劑全血基因組DNA提取試劑盒、CYP2C19基因檢測試劑盒、雜交顯色試劑盒、BR-526-24全自動雜交儀及BE-2.0生物芯片識別儀(上海百傲科技股份有限公司)；PCR擴(kuò)增儀(賽默飛世爾科技有限公司，型號ABI7300)；臺式高速離心機(德國Eppendorf公司，型號Centrifuge 5425 R)；恒溫加熱儀(德國Eppendorf公司，型號ThermoMixer C)。

1.3檢測方法

1.3.1全血基因組DNA提取靜脈取血2 ml，加至EDTA抗凝管中，顛倒混勻后吸取200 μl，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取和純化基因組DNA。提取的DNA濃度通過紫外分光光度計進(jìn)行測定，濃度應(yīng)達(dá)到10～16 ng/μl，A260/A280比值在1.5～2.0之間。DNA樣本-20 ℃保存，凍融不超過3次。

1.3.2PCR擴(kuò)增每份樣本需要擴(kuò)增兩個位點(636G/A，681G/A)，試劑盒根據(jù)擴(kuò)增位點提供特異性引物1及引物2，分別配制2個獨立的反應(yīng)體系。PCR總反應(yīng)體系為25 μl：基因組DNA模板5 μl，CYP2C19擴(kuò)增液(包含基因特異性引物，氯化鉀，dNTP等)19 μl；反應(yīng)液A(Taq聚合酶，UNG酶)1 μl。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 5 min，94 ℃預(yù)變性5 min，35個循環(huán)(94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s， 72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物2～8 ℃保存。

1.3.3全自動雜交及基因型檢測吸取2個CYP2C19反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各10 μl加入180 μl雜交緩沖液中，依次加入預(yù)雜交液、雜交反應(yīng)液、洗脫液、抗體及顯色液，按照雜交顯色試劑盒說明書操作，運行全自動雜交儀，采用單堿基延伸結(jié)合微陣列芯片法對位點進(jìn)行檢測。雜交結(jié)束后取出玻璃芯片，放入BE-2.0生物芯片識別儀進(jìn)行掃描，利用ArrayDoctor軟件及CYP2C19基因型分析程序(上海百傲公司)分析樣品的 CYP2C19 基因型。依據(jù)等位基因功能缺失的不同，分為快代謝基因型*1/*1(681GG/636GG)；中間代謝型*1/*2(636GG/681GA)、*1/*3(636GA/681GG)；慢代謝基因型*2/*2(636GG/681AA)、*2/*3(636GA/681GA)和*3/*3(636AA/681GG)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。按Hardy-Weinberg平衡定律檢驗樣本的群體代表性。用頻數(shù)計數(shù)法計算各基因型及等位基因頻率，各組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1安徽地區(qū)漢族冠心病患者等位基因頻率及CYP2C19代謝型分布采用DNA微陣列基因芯片法，共檢測244例安徽漢族冠心病患者的CYP2C19基因型，各種基因型生物芯片識別圖見圖1。CYP2C19*1、 CYP2C19*2和CYP2C19*3 3種等位基因的頻率分別為60.66%、31.76%和7.58%(表1)。其中*1/*1基因型(636GG，681GG)92例(37.70%)，*1/*2基因型(636GG，681GA)91例(37.30%)，*1/*3基因型(636GA，681GG)21例(8.61%)，*2/*2基因型(636GG，681AA)25例(10.25%)，*3/*3基因型(636AA，681GG)1例(0.41%)，*2/*3基因型(636GA，681GA)14例(5.74%)。根據(jù)基因型判斷，快代謝型92例(37.70%)，中間代謝型112例(45.91%)，慢代謝型40例(16.39 %)，見表2。CYP2C19等位基因分布符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律(χ2=0.519，P=0.991)，說明安徽漢族冠心病患者人群CYP2C19的檢測結(jié)果具有群體代表性。男性和女性的CYP2C19基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.852，P=0.764)；不同性別之間各代謝型頻率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.535，P=0.464)，見表2。

圖1　DNA微陣列芯片法檢測CYP2C19基因多態(tài)性

等位基因男女總計CYP2C19*1179(60.47)117(39.53)296(60.66)CYP2C19*292(59.35)63(40.66)155(31.76)CYP2C19*321(56.76)16(43.24)37(7.58)

2.2不同人群CYP2C19基因多態(tài)性分布比較本研究將不同地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性分布進(jìn)行比較(表3)，結(jié)果顯示，安徽地區(qū)漢族冠心病人群與西安、汕頭及沈陽漢族人群的CYP2C19基因型分布差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CYP2C19基因型分布差異主要體現(xiàn)在快代謝型及中間代謝型，各漢族人群慢代謝型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。安徽漢族冠心病人群快代謝型頻率低于西安、汕頭及沈陽，而中間代謝型正好相反。另外，安徽漢族冠心病人群CYP2C19基因型分布與正常安徽漢族人群相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同民族之間CYP2C19代謝型分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，安徽漢族人群與傣族、白族、回族、維吾爾族、哈薩克斯坦、蒙古族及黎族之間代謝型分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。安徽漢族人群快代謝型比例高于回族及蒙古族，低于傣族、白族、維吾爾族哈薩克斯坦及黎族；中間代謝型人群中，安徽漢族人群高于白族及哈薩克斯坦，低于傣族、回族、維吾爾族、蒙古族及黎族；而在慢代謝型人群中，安徽漢族人群高于傣族、白族、維吾爾族、哈薩克斯坦及黎族，低于回族及蒙古族。

表2　安徽地區(qū)冠心病患者男、女人群CYP2C19基因多態(tài)性分布[n(%)]

表3　不同地區(qū)漢族人群CYP2C19代謝型分布比較[n(%)]

不同地區(qū)漢族資料來自參考文獻(xiàn)[8]；NA：未提供

表4　中國各民族CYP2C19基因多態(tài)性分布比較

不同民族資料來自參考文獻(xiàn)[8]；NA：未提供

3　討論

本研究采用DNA微陣列芯片法對244例安徽漢族冠心病人群的CYP2C19基因多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CYP2C19*1、 CYP2C19*2和CYP2C19*3 3種等位基因的頻率分別為60.66%、31.76%和7.58%，代謝型以快代謝型和中間代謝型為主，這與研究[8]結(jié)果一致。然而仍然有16.39%的冠心病患者為慢代謝型，其對氯吡格雷的抗血小板作用會出現(xiàn)低反應(yīng)甚至毫無應(yīng)答，需要調(diào)整用藥劑量。因此，檢測冠心病患者的CYP2C19基因多態(tài)性對于氯吡格雷個體化合理用藥意義重大。另外，研究顯示冠心病人群與正常人群的基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。前者平均年齡均明顯高于后者。且不同性別人群的CYP2C19基因型及代謝型分布差異也不具有統(tǒng)計學(xué)意義。說明年齡及性別對CYP2C19基因多態(tài)性分布的影響不大。研究顯示，安徽地區(qū)漢族冠心病人群CYP2C19基因多態(tài)性分布與大部分地區(qū)漢族人群一致，僅與西安、汕頭及沈陽漢族人群的CYP2C19基因型分布差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。不同民族之間CYP2C19基因型多態(tài)性分布存在明顯的差異，其中哈薩克斯坦快代謝型頻率最高，蒙古族中間代謝型頻率最高，回族慢代謝型頻率最高，主要是由于各民族地理位置不同。

參考文獻(xiàn)