程艷紅，江瀟瀟，徐修才

慢性髓細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一種起源于多能干細(xì)胞的髓系增殖性腫瘤，BCR-ABL融合基因是該病的特征性改變，融合蛋白具有高酪氨酸激酶活性。伊馬替尼(imatinib, IM)是一種有效的酪氨酸酶抑制劑，目前作為一線治療方案,但是臨床上有15%的CML患者表現(xiàn)出耐藥[1]。盡管臨床上最常見的耐藥機(jī)制是BCR-ABL激酶結(jié)構(gòu)域的突變、異常擴(kuò)增或過表達(dá)。但有研究[2]表明，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，特別是人類有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(human organic cation transporter，OCT-1)和三磷酸腺苷結(jié)合盒蛋白B亞家族成員1 (ATP-binding cassette sub-family B member 1，ABCB1)對于酪氨酸激酶在細(xì)胞內(nèi)的濃度以及對于早期耐藥具有關(guān)鍵性作用。許多研究[3-4]涉及OCT-1和ABCB1在體外對IM早期耐藥過表達(dá)，但到目前為止，外源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在體內(nèi)IM耐藥中的作用幾乎沒有研究。

有研究[5-6]證明BCR-ABL激酶的抑制程度與患者服用IM的療效有關(guān)。而進(jìn)入并且保留在白血病細(xì)胞中IM的量影響B(tài)CR-ABL激酶抑制的程度。影響細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的因素有很多，包括吸收、分布、代謝、排泄等。此外，還與泵入或泵出細(xì)胞內(nèi)外的基因(ABCB1和OCT-1)有關(guān)。因此，該研究探討了這兩個(gè)基因的表達(dá)水平與CML患者IM治療耐藥的關(guān)系。此外，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出大于泵入時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低以及削弱BCR-ABL激酶的抑制程度。由于在治療的第1個(gè)月的激酶抑制水平預(yù)示著患者對IM的反應(yīng)，推測在IM治療的第1個(gè)月內(nèi)ABCB1 mRNA水平明顯升高的CML患者更有可能發(fā)展為IM耐藥，從對接受IM治療的CML患者的療效進(jìn)行評估，并將其與后期的治療療效相關(guān)聯(lián)。該研究通過監(jiān)測IM治療第1個(gè)月內(nèi)的ABCB1 mRNA表達(dá)，以此作為評估CML患者最可能發(fā)生IM耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的手段。

1　材料與方法

1.1病例資料選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血液科2015年6月～2017年6月收治的97例新確診的慢性期CML患者，所有患者經(jīng)臨床表現(xiàn)、骨髓涂片和活檢、BCR-ABL融合基因或Ph染色體診斷確診。男63例，女34例，年齡9～75歲，中位年齡41歲。隨訪時(shí)間1～24個(gè)月，中位隨訪時(shí)間24個(gè)月。試驗(yàn)中涉及到的內(nèi)容均經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，并且與患者簽署知情同意書。

1.2治療方案根據(jù)TIDEL II規(guī)定[7]，分別在患者接受IM治療開始前1天以及在接受IM治療后的30 d采集外周血。分析患者耐藥性風(fēng)險(xiǎn)與ABCB1 mRNA表達(dá)水平的關(guān)系。同時(shí)，在治療的前3個(gè)月復(fù)查1次骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和染色體核型,以及通過RT-PCR檢測BCR-ABL1P210轉(zhuǎn)錄本表達(dá)；3個(gè)月以后每3～6個(gè)月復(fù)查上述指標(biāo)。

1.3療效判定標(biāo)準(zhǔn)參照中國慢性髓性白血病診斷與治療指南(2013年版[8])，最佳反應(yīng)組：治療后12個(gè)月BCR/ABLIS≤0.1%，警告組：12個(gè)月BCR/ABLIS0.1%～1%。治療失敗組：12個(gè)月BCR/ABLIS>1%。總生存率(overall survival, OS)：從IM治療開始至死亡或末次隨訪的時(shí)間。

1.4總RNA的提取采集患者骨髓1～2 ml, EDTA抗凝后，用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，用TRIzol提取試劑盒(美國Invitrogen公司)提取總的RNA。采用分光光度計(jì)檢測RNA濃度，測得患者吸光度(optical density，OD)值，OD260/OD280在1.8～2.0符合檢測要求標(biāo)準(zhǔn)。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析PCR反應(yīng)采用兩步法，PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。根據(jù)PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行總cDNA合成。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃ 保溫，在Gene Amp PCR System 9700上進(jìn)行。應(yīng)用Applied Biosystems7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH基因作為內(nèi)參，每個(gè)基因做2個(gè)復(fù)孔，取平均值，通過2-ΔCt表示各基因的mRNA表達(dá)水平。具體引物序列見表1。

2　結(jié)果

2.1患者的一般情況治療最佳反應(yīng)組46例(47.42%)，警告組23例(23.71%)，治療失敗組28例(28.87%)。97例CML患者2年OS為86.96%。見表2。

表1　各引物序列

表2　97例CML患者的臨床和分子學(xué)反應(yīng)特征[n(%)]

2.2OCT-1、ABCB1mRNA表達(dá)水平與IM治療CML患者的分子學(xué)反應(yīng)關(guān)系根據(jù)CML患者的治療療效，將患者分為兩組，其中警告組(n=23)和治療失敗組(n=28)為一組，最佳反應(yīng)組(n=46)為另一組。分別對兩組的OCT-1、ABCB1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示最佳反應(yīng)組患者的OCT-1 mRNA高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而在警告組和治療失敗組中ABCB1 mRNA高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

2.3BCR/ABL融合基因分子反應(yīng)水平以及OCT-1、ABCB1mRNA表達(dá)水平與總生存率OS之間的關(guān)系本研究隨訪了97例CML患者，隨訪時(shí)間為2年。如圖2A所示，2年OS為86.96%。而BCR/ABL融合基因分子反應(yīng)應(yīng)答最佳反應(yīng)組、警告組和治療失敗組的2年OS分別為91.05%、85.91%、80.63%，三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.487 9)，見圖2B；OCT-1 mRNA高表達(dá)組(90.41%)與OCT-1 mRNA低表達(dá)組(81.87%)的2年OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.280 8)，見圖2C；ABCB1 mRNA高表達(dá)組(86.70%)與ABCB1 mRNA低表達(dá)組(93.13%)的2年OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.349 9)，見圖2D。表明IM治療所獲得的分子學(xué)反應(yīng)以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OCT-1、ABCB1)與2年OS之間無明顯聯(lián)系。

2.4監(jiān)測CML患者ABCB1mRNA表達(dá)水平的倍數(shù)變化對IM治療的反應(yīng)在本研究中，根據(jù)BCR/ABL轉(zhuǎn)錄水平對41例CML患者進(jìn)行分組。通過比較ABCB1 mRNA在診斷第1天與服用IM 30 d后的表達(dá)，并將其表示為倍數(shù)變化。結(jié)果表明，在IM治療的CML患者中2年未達(dá)到最佳反應(yīng)的患者，其治療第30天的ABCB1 mRNA的表達(dá)顯著增加。同時(shí)，最佳反應(yīng)組與未達(dá)到最佳反應(yīng)組(警告組和治療失敗組)的ABCB1 mRNA表達(dá)水平的倍數(shù)變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，見圖3。

今年是國土資源系統(tǒng)實(shí)施“七五”法制宣傳教育工作的中期階段，嘉興市國土資源局始終緊緊圍繞浙江省自然資源廳要求的“法治國土”和市委、市政府要求的“法治嘉興”兩個(gè)法制建設(shè)要求，不斷加強(qiáng)領(lǐng)導(dǎo)、強(qiáng)化措施、聯(lián)系實(shí)際、突出重點(diǎn)、創(chuàng)新形式，積極通過多種形式開展法制宣傳教育活動(dòng)，扎實(shí)推進(jìn)依法行政和普法工作。今年以來，嘉興市國土資源局在市局機(jī)關(guān)開展“文化頌法治”活動(dòng)，在局機(jī)關(guān)干部職工中廣泛征集以法治宣傳為內(nèi)容的書法、繪畫作品，在市局機(jī)關(guān)走廊內(nèi)建立法治國土文化宣傳欄，通過機(jī)關(guān)文化進(jìn)行法治宣傳，不斷提高單位干部職工和廣大人民群眾國土資源保護(hù)意識(shí)和法制觀念。

2.5ABCB1mRNA表達(dá)量的倍數(shù)的增加與BCR/ABLIS水平的關(guān)系通過比較ABCB1 mRNA高表達(dá)組與低表達(dá)組的BCR/ABLIS的百分比，結(jié)果顯示在第1天(P=0.423)或第30天(P=0.160)，BCR/ABLIS百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖1　CML患者IM治療療效與OCT-1、ABCB1 mRNA表達(dá)水平的關(guān)系

圖2　CML患者的2年OS

A：采用Kaplan-Meier法估計(jì)97例CML患者的2年OS；B：根據(jù)BCR/ABL轉(zhuǎn)錄水平分析97例CML患者的2年OS(最佳反應(yīng)組、警告組、治療失敗組)； C：分析91例OCT-1 mRNA高表達(dá)(n=43)和低表達(dá)(n=48)的CML患者2年OS；D：分析93例ABCB1 mRNA高表達(dá)(n=49)和低表達(dá)(n=44)的CML患者的2年OS

圖3　ABCB1 mRNA表達(dá)量的增加對IM治療療效的影響

A:最佳反應(yīng)組(n=20)；B：警告組和治療失敗組(n=21)；與警告組和治療失敗組比較：**P<0.01

圖4　BCR-ABL1IS百分比與ABCB1 mRNA表達(dá)量間的關(guān)系

3　討論

IM作為一種有效的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于慢性骨髓性白血病的治療[9]。但隨著臨床應(yīng)用范圍擴(kuò)大和時(shí)間推移，耐藥現(xiàn)象逐漸顯現(xiàn)，嚴(yán)重影響治療效果。對IM耐藥的機(jī)制研究很多，BCR-ABL酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變是IM耐藥的主要機(jī)制，其他非依賴BCR-ABL的機(jī)制尚不清楚。但是關(guān)于IM耐藥的機(jī)制與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)的研究逐漸成為熱點(diǎn)。

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCT-1能夠誘導(dǎo)IM流入細(xì)胞。而ABCB1是三磷酸腺苷結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員之一，ABCB1基因的超表達(dá)與臨床很多腫瘤藥物耐藥有關(guān)[10]。IM是ABCB1的底物，能被ABCB1泵出，被OCT-1泵入。因此，泵出基因ABCB1和泵入基因OCT-1的差異可能是細(xì)胞內(nèi)IM藥物濃度的重要決定因素，也是影響耐藥因素之一。

在一些臨床研究中，OCT-1 mRNA的表達(dá)水平在患者分子反應(yīng)水平和總體生存率方面與IM治療效果相關(guān)[11-12]。盡管進(jìn)行了許多研究，但對于泵入和泵出對IM療效的作用尚未達(dá)成一致。早期的研究[13]表明，與最佳反應(yīng)者相比，12個(gè)月時(shí)ABCB1 mRNA表達(dá)與無反應(yīng)者或反應(yīng)不佳或進(jìn)展為爆發(fā)性危機(jī)的患者相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相反，本文提供的數(shù)據(jù)在治療開始后不久以及延長治療后檢查ABCB1 mRNA表達(dá)，并將其與患者實(shí)現(xiàn)主要分子學(xué)反應(yīng)的能力相關(guān)聯(lián)。在本研究中，根據(jù)BCR-ABL融合基因表達(dá)水平將CML患者分成兩組，通過檢測OCT-1和ABCB1的mRNA表達(dá)水平，顯示相對于警告組和治療失敗組，最佳反應(yīng)組CML患者的OCT-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高。相反，ABCB1 mRNA的表達(dá)水平卻明顯降低。警告組和治療失敗組伴有OCT-1低表達(dá)和ABCB1高表達(dá)，說明藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是IM治療的重要因素。

進(jìn)一步分析CML患者的2年OS，以及治療療效、OCT-1和ABCB1 mRNA的表達(dá)水平對OS的影響。結(jié)果表明最佳反應(yīng)組、警告組以及治療失敗組間的2年OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)OCT-1 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組、ABCB1 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組的2年OS差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可以推斷，除BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平之外，還存在其他預(yù)測OS的重要因素。

除此之外，為了探討ABCB1 mRNA表達(dá)水平對CML患者發(fā)展為耐藥性是否具有預(yù)測作用，分別監(jiān)測了CML患者初診第1天和IM治療30 d的ABCB1 mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示ABCB1 mRNA表達(dá)發(fā)生變化，鑒于倍數(shù)變化測量兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的表達(dá)差異。結(jié)果表明相對于最佳反應(yīng)組，警告組和治療失敗組的ABCB1 mRNA表達(dá)水平在伊馬替尼治療第30天明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，當(dāng)白血病患者負(fù)擔(dān)仍然明顯時(shí)(例如，第30天)，治療一段時(shí)間后ABCB1 mRNA表達(dá)量的測定可更好地反映白血病人群中ABCB1 mRNA的相對水平。在未能實(shí)現(xiàn)主要分子學(xué)反應(yīng)以及進(jìn)展和(或)發(fā)展突變的患者中，ABCB1 mRNA表達(dá)增加，并且在治療早期階段監(jiān)測ABCB1 mRNA水平可以作為一種重要預(yù)測治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。此外，在治療早期BCR/ABLIS百分比是CML患者長期治療反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)[14-15]，因此，為了研究在治療第1個(gè)月內(nèi)ABCB1 mRNA表達(dá)水平與BCR/ABLIS百分比是否相關(guān)，本研究比較了BCR/ABLIS百分比在兩組之間的差異(ABCB1 mRNA的高表達(dá)與低表達(dá)組)。在第1天或第30天，BCR/ABLIS百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。總之，這些結(jié)果表明，IM治療初診第1天和第30天之間ABCB1 mRNA表達(dá)的倍數(shù)變化為確定可能對IM反應(yīng)不良或反應(yīng)不佳的患者提供了一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物。盡管如此，關(guān)于影響ABCB1 mRNA表達(dá)量升高的生物學(xué)因素尚未清楚，有待進(jìn)一步地探討。